Структура и биологическая роль нуклеотидов, нуклеиновых кислот. Репликация ДНК и транскрипция.

Первичная структура нуклеиновых кислот. Особенности строения ДНК и РНК и их функции в клетке.

4.2.1. Первичной структурой нуклеиновых кислот называется последовательность расположения мононуклеотидов в цепи ДНК или РНК. Первичная структура нуклеиновых кислот стабилизируется 3',5'-фосфодиэфирными связями. Эти связи образуются при взаимодействии гидроксильной группы в 3'-положении пентозного остатка каждого нуклеотида с фосфатной группой соседнего нуклеотида (рисунок 3.2),

Таким образом, на одном конце полинуклеотидной цепи имеется свободная 5'-фосфатная группа (5'-конец), а на другом - свободная гидроксильная группа в 3'-положении (3'-конец). Нуклеотидные последовательности принято записывать в направлении от 5'-конца к 3'-концу.

Рисунок 4.2. Структура динуклеотида, в состав которого входят аденозин-5'-монофосфат и цитидин-5'-монофосфат.

4.2.2. ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота) содержится в клеточном ядре и имеет молекулярную массу порядка 1011 Да. В состав её нуклеотидов входят азотистые основания аденин, гуанин, цитозин, тимин, углевод дезоксирибоза и остатки фосфорной кислоты. Содержание азотистых оснований в молекуле ДНК определяют правила Чаргаффа:

1) количество пуриновых оснований равно количеству пиримидиновых (А + Г = Ц + Т) ;

2) количество аденина и цитозина равно количеству тимина и гуанина соответственно (А = Т; Ц = Г) ;

3) ДНК, выделенные из клеток различных биологических видов, отличаются друг от друга величиной коэффициента специфичности:

(Г + Ц) /(А + Т)

Эти закономерности в строении ДНК объясняются следующими особенностями её вторичной структуры:

1) молекула ДНК построена из двух полинуклеотидных цепей, связанных между собой водородными связями и ориентированных антипараллельно (то есть 3'-конец одной цепи расположен напротив 5'-конца другой цепи и наоборот);

2) водородные связи образуются между комплементарными парами азотистых оснований. Аденину комплементарен тимин; эта пара стабилизируется двумя водородными связями. Гуанину комплементарен цитозин; эта пара стабилизируется тремя водородными связями (см. рисунок б) . Чем больше в молекуле ДНК пар Г-Ц, тем больше её устойчивость к действию высоких температур и ионизирующего излучения;

Рисунок 3.3. Водородные связи между комплементарными азотистыми основаниями.

3) обе цепи ДНК закручены в спираль, имеющую общую ось. Азотистые основания обращены внутрь спирали; кроме водородных, между ними возникают также гидрофобные взаимодействия. Рибозофосфатные части расположены по периферии, образуя остов спирали (см. рисунок 3.4).

Рисунок 3.4. Схема строения ДНК.

4.2.3. РНК (рибонуклеиновая кислота) содержится преимущественно в цитоплазме клетки и имеет молекулярную массу в пределах 104 - 106 Да. В состав её нуклеотидов входят азотистые основания аденин, гуанин, цитозин, урацил, углевод рибоза и остатки фосфорной кислоты. В отличие от ДНК, молекулы РНК построены из одной полинуклеотидной цепи, в которой могут находиться комплементарные друг другу участки (рисунок 3.5). Эти участки могут взаимодействовать между собой, образуя двойные спирали, чередующиеся с неспирализованными участками.

Рисунок 3.5. Схема строения транспортной РНК.

По особенностям структуры и функции различают три основных типа РНК:

1) матричные (информационные) РНК (мРНК) передают информацию о структуре белка из клеточного ядра на рибосомы;

2) транспортные РНК (тРНК) осуществляют транспорт аминокислот к месту синтеза белка;

3) рибосомальные РНК (рРНК) входят в состав рибосом, участвуют в синтезе белка.

• репликация РНК – синтез РНК на матрице РНК;
• обратная транскрипция – синтез ДНК с использованием в качестве матрицы молекулы РНК.

1. Мономеры (нуклеотиды, аминокислоты) непосредственно в синтезе полимеров участвовать не могут; они должны находиться в активной форме – нуклеотиды – в виде нуклеозидтрифосфатов, аминокислоты – в виде соединений с тРНК.
2. Синтез всех полинуклеотидных и полипептидных цепей складывается из трёх основных этапов – инициации, элонгации и терминации.
3. На матрице имеется специальный сигнал или группа сигналов, позволяющие опознать кодирующий элемент, с которого начинается информация о синтезируемой цепи биополимера. Этот сигнал, как правило, не совпадает с точкой физического начала полимерной цепи матрицы. Инициация – процесс, в котором происходит присоединение первого мономерного звена к молекуле-матрице.
4. На каждый акт инициации биосинтеза приходится большое количество актов элонгации, т.е. соединения очередного мономера с растущей цепью. В элонгации участвуют 3 компонента: а) концевая группа синтезируемого полимера, б) кодирующий элемент матрицы, в) очередная молекула активного мономера. Все они должны быть зафиксированы определённым образом в активном центре фермента или рибосомы.
5. Каждый акт элонгации начинается с отбора субстратов путём перебора всех присутствующих субстратов в системе. Попадание в активный центр нужного субстрата является сигналом для осуществления ферментативной реакции соединения мономерного фрагмента с концом синтезируемой полимерной цепи. Присоединение мономера к растущей цепи служит сигналом для перемещения активного центра на один кодирующий элемент матрицы.
6. Конец продукта чаще всего не соответствует концу матрицы, на ней должен быть специальный сигнал, обеспечивающий прекращение роста цепи, т.е. терминацию.
7. Синтез биологически активной молекулы, как правило, не заканчивается терминацией. Образующийся полимер претерпевает ряд превращений, таких как частичный гидролиз и объединение нескольких цепей в одну, модификация мономеров в составе полимера, присоединение простетической части (к полипептиду) или апопротеина (к полинуклеотиду).

Репликация и репарация ДНК.

4.4.1. Репликация – процесс самоудвоения ДНК, или биосинтез дочерней молекулы ДНК, полностью идентичной исходной молекуле (матрице). Локализация процесса – клеточное ядро. Основные принципы репликации ДНК:

• комплементарность - синтезируемые цепи комплементарны матрице;
• антипараллельность - 5'-конец синтезируемой полинуклеотидной цепи находится напротив 3'-конца матрицы и наоборот;
• униполярность - синтез полинуклеотидных цепей происходит всегда в направлении 5' → 3';
• потребность в затравке -  ферменты, синтезирующие ДНК, способны лишь наращивать существующую полинуклеотидную цепь, поэтому вначале синтезируется короткая цепь РНК (затравка или праймер), к которой присоединяются дезоксирибонуклеотиды; выполнившая свою роль РНК-затравка удаляется;
• прерывистость - одна из дочерних цепей (лидирующая) в процессе репликации растёт непрерывно, а другая (отстающая) - в виде фрагментов длиной в несколько сот нуклеотидов (фрагментов Оказаки);
• полуконсервативность - в результате репликации образуются две двойные дочерние ДНК, каждая из которых сохраняет (консервирует) в неизменном виде одну из половин материнской ДНК.

4.4.2. Условия, необходимые для репликации ДНК:

Рисунок 8.1. Репликация ДНК (объяснения в тексте).

1) Матрица – молекула ДНК (рисунок 26.1, а);

2) Расплетающие белки – разрывают водородные связи между комплементарными основаниями двойной спирали ДНК, в результате чего образуется репликативная вилка (рисунок 26.1, б);

3) ДНК-связываюшие белки - присоединяются к разделившимся цепям ДНК и препятствуют их обратному воссоединению;

4) Праймаза (РНК-полимераза) - фермент, синтезирующий затравочную РНК.

5) Субстраты и источники энергии – дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (дАТФ, дГТФ, дТТФ, дЦТФ). Присоединяются к азотистым основаниям полинуклеотидных цепей при помощи водородных связей по принципу комплементарности;

6) ДНК-полимераза – фермент, который формирует из нуклеозидтрифосфатов новые полинуклеотидные цепи за счёт образования 3’,5’-фосфодиэфирных связей. Источником энергии служат макроэргические связи нуклеозидтрифосфатов. На одной ветви репликативной вилки синтезируется непрерывная цепь, на другой – фрагменты Оказаки (рисунок 26.1, в);

7) ДНК-лигаза – фермент, соединяющий фрагменты Оказаки в единую цепь (рисунок 26.1, г).

В результате образуются две идентичные молекулы ДНК (рисунок 26.1, д).

4.4.3. Репарация ДНК - процесс, позволяющий живым организмам восстанавливать повреждения, возникающие в ДНК. Все репарационные механизмы основаны на том, что молекула ДНК состоит из двух полинуклеотидных цепей. Если нуклеотидная последовательность одной из двух цепей оказывается повреждённой (изменённой), информацию можно восстановить, так как вторая (комплементарная) цепь сохранена.

Процесс репарации происходит в несколько этапов:

• выявление нарушения комплементарности цепей ДНК;
• устранение некомплементарного нуклеотида (или только основания);
• восстановление целостности цепи по принципу комплементарности.

Очень редко происходят повреждения, затрагивающие обе цепи ДНК, т.е. нарушения структуры нуклеотидов комплементарной пары. Такие повреждения в половых клетках не репарируются, так как для осуществления сложной репарации с участием гомологичной рекомбинации требуется наличие диплоидного набора хромосом.

Нарушения комплементарности цепей ДНК могут возникать самопроизвольно (спонтанные повреждения) или в результате воздействия физических или химических факторов (индуцируемые повреждения).

К спонтанным повреждениям относятся:

• ошибки репликации (ДНК-полимераза а лишена корректирующего механизма и "ошибается" чаще, чем другие полимеразы);
• депуринизация в результате разрыва гликозидных связей между пуриновыми основаниями и дезоксирибозой;
• дезаминирование азотистых оснований – превращение цитозина в урацил, аденина в гипоксантин, гуанина в ксантин.

К индуцируемым повреждениям относятся повреждения ДНК в результате воздействия радиации или химических веществ:

• Образование димеров пиримидиновых оснований (тимина или цитозина);
• Повреждения оснований ДНК химическими мутагенами (алкилирование, окисление, восстановление или связывание основания с формамидными группировками).

Ферменты, участвующие в процессе репарации:

• ДНК-гликозилаза;
• эндонуклеаза;
• экзонуклеаза;
• ДНК-полимераза β;
• ДНК-лигаза;
• ДНК-инсертаза.

Раздел 4.5

Транскрипция

4.5.1. Транскрипция – биосинтез РНК на матрице ДНК. Процесс транскрипции также происходит в клеточном ядре. Основные принципы транскрипции:

• комплементарность - синтезируемые цепи комплементарны матрице;
• антипараллельность - 5'-конец синтезируемой полинуклеотидной цепи находится напротив 3'-конца матрицы и наоборот;
• униполярность - синтез полинуклеотидных цепей происходит всегда в направлении 5' → 3';
• беззатравочность - биосинтез РНК не требует наличия праймера;
• асимметричность - синтез дочерней цепи идёт только на одной цепи ДНК-матрицы, вторая при этом блокирована.

• Матрица – участок одной из цепей ДНК (рисунок 8.2, а);
• ДНК-зависимая РНК-полимераза – главный фермент, участвующий в транскрипции. Место присоединения фермента к ДНК – промотор;
• Субстраты и источники энергии – рибонуклеозидтрифосфаты (АТФ, ГТФ, УТФ, ЦТФ). Связываются с азотистыми основаниями транскрибируемой цепи ДНК водородными связями по принципу комплементарности.

В результате образуются первичные транскрипты – предшественники мРНК, тРНК и рРНК. Затем происходит их посттранскрипционное созревание (процессинг).

4.5.3. Процессинг мРНК включает:

• вырезание неинформативных участков – интронов (рисунок 8.2, в);
• сращивание (сплайсинг) информативных участков – экзонов (рисунок 8.2, г);
• защиту концевых участков от действия нуклеаз (рисунок 8.2, д):
  • присоединение 7-метилгуанилата («колпачок») к 5’-концу 5’,5’- фосфодиэфирной связью;
  • присоединение полиаденилового нуклеотида к 3’-концу.

Образующаяся мРНК поступает из ядра в цитоплазму клеток.

Обучающие задачи и эталоны их решения

Задачи.

1. В молекуле ДНК адениловый нуклеотид составляет 35% от общего содержания нуклеотидов. Рассчитайте (в %) количество каждого из остальных нуклеотидов.

2. В препаратах ДНК, выделенных из двух видов микроорганизмов, содержание тимина составляет соответственно 29 и 16% от общего содержания оснований. Рассчитайте процентное содержание аденина, гуанина и цитозина в этих препаратах ДНК. Какая из ДНК будет более устойчивой к действию высоких температур?

Эталоны решения.

1. Согласно правилам Чаргаффа, количество аденина в ДНК равно количеству тимина. Поэтому содержание тимидилового нуклеотида также составляет 35%. На долю остальных нуклеотидов приходится 100% - (35 x 2)% = 30%. Количество гуанина в ДНК равняется количеству цитозина, поэтому содержание каждого из них - 30% : 2 = 15%. Итак, А = 35%, Г = 15%, Ц = 15%, Т = 35% (см. 3.4.).

2. Согласно правилам Чаргаффа, содержание оснований в первом препарате ДНК составляет: А = 29%, Г = 21%, Ц = 21%; во втором препарате - А = 16%, Г = 34%, Ц = 34%, очевидно, что содержание пар Г - Ц во втором препарате значительно выше. Поэтому данная молекула ДНК более устойчива к действию температуры (см. 3.4.).