1. Предмет и задачи медицинской микробиологии, вирусологии.
Микробиология — наука, изучающая строение, жизнедеятельность и экологию микроорганизмов — мельчайших форм жизни растительного или животного происхождения, не видимых невооруженным глазом. Микробиология изучает всех представителей микромира (бактерии, грибы, простейшие, вирусы). По своей сути микробиология является биологической фундаментальной наукой. Для изучения микроорганизмов она использует методы других наук, прежде всего физики, биологии, биоорганической химии, молекулярной биологии, генетики, цитологии, иммунологии. Как и всякая наука, микробиология подразделяется на общую и частную. Общая микробиология изучает закономерности строения и жизнедеятельности микроорганизмов на всех уровнях — молекулярном, клеточном, популяционном; генетику и взаимоотношения их с окружающей средой. Предметом изучения частной микробиологии являются отдельные представители микромира в зависимости от проявления и влияния их на окружающую среду, живую природу, в том числе человека. К частным разделам микробиологии относятся: медицинская, ветеринарная, сельскохозяйственная, техническая (раздел биотехнологии), морская, космическая микробиология.
Многочисленные открытия в области микробиологии, изучение взаимоотношений между макро- и микроорганизмами во второй половине XIX в. способствовали началу бурного развития иммунологии. Вначале иммунология рассматривалась как наука о невосприимчивости организма к инфекционным болезням. В настоящее время она стала общемедицинской и общебиологической наукой. Доказано, что иммунная система служит для защиты организма не только от микробных агентов, но и от любых генетически чужеродных организму веществ с целью сохранения постоянства внутренней среды организма, т.е. гомеостаза.
Предмет микробиологии – мир микроорганизмов растительного и животного происхождения.
Задачи микробиологии – изучение свойств микроорганизмов.
2. История развития микробиологии и вирусологии. Открытия А. Левенгука, Л. Пастера, Р. Коха, Д.И.Ивановского.
Историю развития микробиологии можно разделить на пять этапов: эвристический, морфологический, физиологический, иммунологический и молекулярно-генетический.
Пастер сделал ряд выдающихся открытий. За короткий период с 1857 по 1885 г. он доказал, что брожение (молочнокислое, спиртовое, уксуснокислое) не является химическим процессом, а его вызывают микроорганизмы; опроверг теорию самозарождения; открыл явление анаэробиоза, т.е. возможность жизни микроорганизмов в отсутствие кислорода; заложил основы дезинфекции, асептики и антисептики; открыл способ предохранения от инфекционных болезней с помощью вакцинации.
Многие открытия Л. Пастера принесли человечеству огромную практическую пользу. Путем прогревания (пастеризации) были побеждены болезни пива и вина, молочнокислых продуктов, вызываемые микроорганизмами; для предупреждения гнойных осложнений ран введена антисептика; на основе принципов Л. Пастера разработаны многие вакцины для борьбы с инфекционными болезнями.
Однако значение трудов Л. Пастера выходит далеко за рамки только этих практических достижений. Л. Пастер вывел микробиологию и иммунологию на принципиально новые позиции, показал роль микроорганизмов в жизни людей, экономике, промышленности, инфекционной патологии, заложил принципы, по которым развиваются микробиология и иммунология и в наше время.
Л. Пастер был, кроме того, выдающимся учителем и организатором науки.
Работы Л. Пастера по вакцинации открыли новый этап в развитии микробиологии, по праву получивший название иммунологического.
Принцип аттенуации (ослабления) микроорганизмов с помощью пассажей через восприимчивое животное или при выдерживании микроорганизмов в неблагоприятных условиях (температура, высушивание) позволил Л. Пастеру получить вакцины против бешенства, сибирской язвы, куриной холеры; этот принцип до настоящего времени используется при приготовлении вакцин. Следовательно, Л. Пастер является основоположником научной иммунологии, хотя и до него был известен метод предупреждения оспы путем заражения людей коровьей оспой, разработанный английским врачом Э. Дженнером. Однако этот метод не был распространен на профилактику других болезней.
Роберт Кох. Физиологический период в развитии микробиологии связан также с именем немецкого ученого Роберта Коха, которому принадлежит разработка методов получения чистых культур бактерий, окраски бактерий при микроскопии, микрофотографии. Известна также сформулированная Р. Кохом триада Коха, которой до сих пор пользуются при установлении возбудителя болезни.
Д.И.Ивановский (1864— 1920) открыл вирусы — представителей царства vira. Один из основоположников вирусологии. Впервые открыл проходящий через бактериологические фильтры возбудитель табачной мозаики, названный впоследствии вирусом. Труды по фитопатологии и физиологии растений.
А. Левенгук изобрел микроскоп.
3. Связь микробиологии с другими дисциплинами. Значение медицинской микробиологии в практической деятельности врача-педиатра.
Ответа нет.
4. Систематика микробов. Принципы систематики. Понятия вид, штамм, культура, клон, популяция.
Микробы, или микроорганизмы (бактерии, грибы, простейшие, вирусы), систематизированы по их сходству, различиям и взаимоотношениям между собой. Этим занимается специальная наука — систематика микроорганизмов. Систематика включает три части: классификацию, таксономию и идентификацию. В основу таксономии микроорганизмов положены их морфологические, физиологические, биохимические и молекулярно-биологические свойства. Различают следующие таксономические категории: царство, подцарство, отдел, класс, порядок, семейство, род, вид, подвид и др. В рамках той или иной таксономической категории выделяют таксоны — группы организмов, объединенные по определенным однородным свойствам.
Микроорганизмы представлены доклеточными формами (вирусы — царство Vira) и клеточными формами (бактерии, архебактерии, грибы и простейшие). Различают 3 домена (или «империи»): «Bacteria», «Archaea» и «Eukarya»:
□ домен «Bacteria» — прокариоты, представленные настоящими бактериями (эубактериями);
□ домен «Archaea» — прокариоты, представленные архебактериями;
□ домен «Eukarya» — эукариоты, клетки которых имеют ядро с ядерной оболочкой и ядрышком, а цитоплазма состоит из высокоорганизованных органелл — митохондрий, аппарата Гольджи и др. Домен «Eukarya» включает: царство Fungi (грибы); царство животных Animalia (включает прстейшие – подцарство Protozoa); царство растений Plante. Домены включают царства, типы, классы, порядки, семейства, роды, виды.
Вид. Одной из основных таксономических категорий является вид (species). Вид — это совокупность особей, объединенных по близким свойствам, но отличающихся от других представителей рода.
Чистая культура. Совокупность однородных микроорганизмов, выделенных на питательной среде, характеризующихся сходными морфологическими, тинкториальными (отношение к красителям), культуральными, биохимическими и антигенными свойствами, называется чистой культурой.
Штамм. Чистая культура микроорганизмов, выделенных из определенного источника и отличающихся от других представителей вида, называется штаммом. Штамм — более узкое понятие, чем вид или подвид.
Клон. Близким к понятию штамма является понятие клона. Клон представляет собой совокупность потомков, выращенных из единственной микробной клетки.
Для обозначения некоторых совокупностей микроорганизмов, отличающихся по тем или иным свойствам, употребляется суффикс var (разновидность) вместо ранее применявшегося type.
5. Классификация бактерий. Понятие о таксономии и номенклатуре бактерий.
Для бактерий рекомендованы следующие таксономические категории: класс, отдел, порядок, семейство, род, вид. Название вида соответствует бинарной номенклатуре, т. е. состоит из двух слов. Например, возбудитель сифилиса пишется как Treponema pallidum. Первое слово — название рода и пишется с прописной буквы, второе слово обозначает вид и пишется со строчной буквы. При повторном упоминании вида родовое название сокращается до начальной буквы, например: Т. pallidum.
Бактерии относятся к прокариотам, т. е. доядерным организмам, поскольку у них имеется примитивное ядро без оболочки, ядрышка, гистонов, а в цитоплазме отсутствуют высокоорганизованные органеллы (митохондрии, аппарат Гольджи, лизосомы и др.).
Бактерии делят на 2 домена: «Bacteria» и «Archaea».
В домене «Bacteria» можно выделить следующие бактерии:
1) бактерии с тонкой клеточной стенкой, грамотрицательные;
2) бактерии с толстой клеточной стенкой, грамположительные;
3) бактерии без клеточной стенки (класс Mollicutes — микоплазмы)
Архебактерии не содержат пептидогликан в клеточной стенке. Они имеют особые рибосомы и рибосомные РНК (рРНК).
Среди тонкостенных грамотрицательных эубактерий различают:
• сферические формы, или кокки (гонококки, менингококки, вейлонеллы);
• извитые формы — спирохеты и спириллы;
• палочковидные формы, включая риккетсии.
К толстостенным грамположительным эубактериям относят:
• сферические формы, или кокки (стафилококки, стрептококки, пневмококки);
• палочковидные формы, а также актиномицеты (ветвящиеся, нитевидные бактерии), коринебактерии (булавовидные бактерии), микобактерии и бифидобактерии.
Тонкостенные грамотрицательные бактерии: Менингококки, гонококки, Вейлонеллы, Палочки, Вибрионы, Кампилобактерии, Хеликобактерии, Спириллы, Спирохеты, Риккетсии, Хламидии.
Толстостенные грамположительные бактерии: Пневмококки, Стрептококки, Стафилококки, Палочки, Бациллы, Клостридии, Коринебактерии, Микобактерии, Бифидобактерии, Актиномицеты.
Микроорганизмы систематизированы по сходству, различиям и взаимоотношениям между собой.
Систематика состоит из:
Классификация микробов
Приняты классификации:
Классификация бактерий
Согласно руководству Берджи (2001) бактерии делятся на 2 домена:
В домен Bacteria входят 22 типа, 6 из них имею медицинское значение.
Основы таксономии микробов
Свойства микроорганизмов
Вид – совокупность родственных микроорганизмов, имеющих общие генетические, а следовательно общие биологические свойства.
Salmonella(род) typhi(вид)
Разновидность – отличается от вида небольшим маленьким, но резко отличающимся признаком.
Подвид – своеобразие, чисто экспериментальное, с небольшим признаком вида.
Штамм – любая чистая культура выделенная у человека, животных или внешней среды.
Варианта – небольшие отличия по конкретным свойствам. Биовар – биологический вариант. Морфовар – морфологические свойства. Хемовар – химические свойства.
Идентификация бактерий
Исследуют следующие показатели
6. Морфология микробов. Основные признаки прокариотической клетки.
Структура бактериальной клетки.
Бактериальная клетка состоит из оболочки или клеточной стенки, цитоплазматической мембраны и цитоплазмы с нуклеоидом и включениями (рис. 12 – см. приложение). У отдельных видов бактерий имеются жгутики (органы движения), пили (реснички, фимбрии), капсулы, споры.
Оболочка обеспечивает форму бактерии, защищает ее от неблагоприятных внешних воздействий и высокого внутреннего осмотического давления. Она имеет многослойную структуру и сложный химический состав, отличающийся у грамположительных и грамотрицательных бактерий. В состав оболочек всех бактерий входит ригидный слой (пептидогликан), в состав которого входят уникальные вещества, не обнаруженные у других видов живых существ – D (правовращающие) аминокислоты, диаминопимелиновая кислота. У грамположительных бактерий клеточная стенка содержит особые тейхоевые кислоты, она толще и содержит меньше липидов, чем у грамотрицательных бактерий. Оболочка грамотрицательных бактерий содержит полипептидные и полисахаридные слои. Снаружи клеточной стенки расположен слизистый слой, который у ряда бактерий может набухать, увеличиваясь в размерах, образуя капсулу. Капсула состоит из полисахаридов, реже – из полипептидов, обладает малым сродством к красителям, поэтому для ее выявления применяют негативные методы окраски, например, метод Гинса-Бурри. У некоторых патогенных бактерий (пневмококк, сибиреязвенная палочка) капсула образуется исключительно в организме животного или человека, тогда как у других видов бактерий (клебсиеллы) капсулообразование наблюдается при культивировании на питательных средах. Капсула защищает бактерию от действия неблагоприятных воздействий внешней среды и факторов иммунитета. Имеются непатогенные виды бактерий, которые при размножении в растворе сахара образуют капсулы, при этом растворы приобретают слизистую консистенцию.
Цитоплазма бактерий может быть гомогенной, равномерно окрашивающейся, или содержать разнообразные включения органической и минеральной природы (включения волютина, фосфатов, серы, липидов и т.д.), выполняющие функции резервных веществ. Зерна волютина являются запасными питательными веществами и для некоторых видов бактерий (дифтерийная палочка) могут быть дифференциально-диагностическим признаком. Для выявления зерен волютина применяют специальный метод окраски по Нейссеру. Цитоплазма прокариотов покрыта цитоплазматической мембраной – аналогом митохондрий эукариотов, играющей жизненно важную роль в обменных (окислительно- восстановительных) реакциях у бактерий
При электронной микроскопии срезов бактериальной клетки в цитоплазме отчетливо видны нуклеоид (аналог ядра эукариотов), рибосомы и мезосомы – выпячивания внутреннего слоя цитоплазматической мембраны. Мезосомы принимают участие в делении бактерий и создании их оболочки.
Величина бактерий измеряется в микрометрах. Большинство кокков имеют диаметр около 0,5—1 мкм, у палочковидных форм поперечный размер составляет 0,5— 2 мкм, а длина варьирует в широких пределах. Длинные формы (до 500 мкм) могут наблюдаться среди спирохет.
Некоторые виды палочковидных бактерий в неблагоприятных условиях существования образуют споры. Спорообразующие палочковидные бактерии называют бациллами или клостридиями, а неспорообразующие - бактериями. Из патогенных бактерий спорообразующими являются сибиреязвенная палочка, возбудители столбняка, газовой гангрены, ботулизма. Спорообразование обеспечивает сохранение вида в неблагоприятных условиях. Спора по своей устойчивости к различным факторам внешней среды значительно превосходит вегетативную форму, из которой она образовалась. От вегетативной формы спора отличается меньшим содержанием воды и плотной, многослойной оболочкой, содержащей липиды, а также наличием особого вещества – дипиколината кальция, что обеспечивает высокую устойчивость спор к действию неблагоприятных факторов, в том числе, высыханию, повышенной или пониженной температуре и проч. в течение длительного промежутка времени. Процесс спорообразования заканчивается отмиранием и лизисом вегетативной формы. Попадая в благоприятные условия, спора быстро прорастает, вновь превращаясь в вегетативную форму. Спора, образующаяся внутри цитоплазмы бактериальной клетки, может иметь круглую или овальную форму, располагаясь в центре (центрально), на конце (терминально) или ближе к одному из концов (субтерминально) (рис. 13). Форма, величина и расположение споры являются характерной особенностью вида бактерий.
7. Ультраструктура и химический состав бактерий. Строение и функции оболочки грамположительных и грам-отрицательных бактерий.
Бактериальная клетка состоит из клеточной стенки, цитоплазматической мембраны, цитоплазмы с включениями и ядра, называемого нуклеоидом. Имеются дополнительные структуры: капсула, микрокапсула, слизь, жгутики, пили. Некоторые бактерии в неблагоприятных условиях способны образовывать споры.
Клеточная стенка. В клеточной стенке грамположительных бактерий содержится небольшое количество полисахаридов, липидов, белков. Основным компонентом толстой клеточной стенки этих бактерий является многослойный пептидогликан (муреин, мукопептид), составляющий 40-90 % массы клеточной стенки. С пептидогликаном клеточной стенки грамположительных бактерий ковалентно связаны тейхоевые кислоты (от греч. teichos — стенка).
В состав клеточной стенки грамотрицательных бактерий входит наружная мембрана, связанная посредством липопротеина с подлежащим слоем пептидогликана. На ультратонких срезах бактерий наружная мембрана имеет вид волнообразной трехслойной структуры, сходной с внутренней мембраной, которую называют цитоплазматической. Основным компонентом этих мембран является бимолекулярный (двойной) слой липидов. Внутренний слой наружной мембраны представлен фосфолипидами, а в наружном слое расположен липополисахарид.
Функции клеточной стенки:
1. Обусловливает форму клетки.
2. Защищает клетку от механических повреждений извне и выдерживает значительное внутреннее давление.
3. Обладает свойством полупроницаемости, поэтому через нее избирательно проникают из среды питательные вещества.
4. Несет на своей поверхности рецепторы для бактериофагов и различных химических веществ.
Метод выявления клеточной стенки - электронная микроскопия, плазмолиз.
L-формы бактерий, их медицинское значение
L-формы - это бактерии, полностью или частично лишенные клеточной стенки (протопласт +/- остаток клеточной стенки), поэтому имеют своеобразную морфологию в виде крупных и мелких сферических клеток. Способны к размножению.
Цитоплазматическая мембрана располагается под клеточной стенкой (между ними - периплазматическое пространство). По строению является сложным липидобелковым комплексом, таким же, как у клеток эукариот (универсальная мембрана).
Функции цитоплазматической мембраны:
1. Является основным осмотическим и онкотическим барьером.
2. Участвует в энергетическом метаболизме и в активном транспорте питательных веществ в клетку, так как является местом локализации пермеаз и ферментов окислительного фосфорилирования.
3. Участвует в процессах дыхания и деления.
4. Участвует в синтезе компонентов клеточной клетки (пептидогликана).
5. Участвует в выделении из клетки токсинов и ферментов.
Цитоплазматическая мембрана выявляется только при электронной микроскопии.
8. Химический состав, строение, функции капсул, методы их выявления.
Капсулы бактерий
Выявление капсул – метод Гинса-Бурри
Возбудитель сибирской язвы – образует капсулу только в человеке или в животном.
Свойства капсулы бактерий
Строение капсулы – Bacillus anthracis – сибирская язва
Капсула не выявляется при окрашивании обычными методами, так как входящие в ее состав слизистые вещества полисахаридной природы, окрашиваются плохо или не окрашиваются совсем. Для выявления капсул (например, у пневмококка - Streptococcus pneumoniae) можно использовать простые или сложные (по Граму, Гинсу-Бурри) методы окраски, при этом в мазке, окрашенном простыми методами, на фоне окрашенной ткани органа видны мелкие неокрашенные капсулы, внутри которых попарно (диплококки) или одиночно располагаются грамположительные ланцетовидные пневмококки. Методика окраски капсул по методу Гинса-Бурри заключается в следующем:
уголком шлифованного стекла обе капли перемешивают и по поверхности предметного стекла плоскостью шлифованного угла делают мазок. После подсушивания мазок осторожно фиксируют в пламени спиртовки, окрашивают в течение 1-2 мин. разбавленным 1:3 фуксином Циля, высушивают и микроскопируют. При микроскопии фон препарата темно-бурый, клетки бактерий красные. Капсулы выглядят в виде бесцветных овалов вокруг красных клеток бактерий (рис. 7).
9. Химический состав, строение, функции спор, методы их выявления.
Споры бактерий
- Образуются у Грам(+) бактерий при неблагоприятных условиях
- Спора, предназначена сохранять вид бактерий и не является способом размножения
- Споры бактерий рода Bacillus не превышают диаметр клетки
- Споры бактерий рода Clostridium превышают диаметр клетки
Bacillus anthracis
Спора очень устойчива во внешней среде, предназначена для сохранения вида.
Споры бактерий. ПО расположению спор
А. Терминальное
Б. Субтерминальное
С. Центральное
Химический состав споры
- Низкое содержание H2O, K,P
- высокое содержание Ca, Mg
Структура споры
Стадии спорогенеза
Стадии прорастания споры
-Активация споры(повреждение оболочек)
-Начальная стадия(начало формирования вегетативной клетки)
-Стадия роста
Окраска спор по методу Ауески. В связи с многослойной структурой и особенностями химического состава споры они не окрашиваются обычными методами. Поэтому, как и при окраске по методу Циля-Нильсена, применяют концентрированный карболовый фуксин Циля. Окраска модифицированным методом Ауески выполняется по методу Циля-Нильсена, однако обесцвечивание проводится 0,5% HCl. Необходимо избегать грубой фиксации мазка над пламенем. Вегетативные клетки бактерий окрашиваются в голубой цвет, споры - в ярко-малиновый.
10. Протопласты, сферопласты, L-формы бактерий и их значение в патологии человека.
Безоболочечные формы бактерий
- Протопласты – бактерии, полностью лишенные клеточной стенки, нежизнеспособны
- Сферопласты – бактерии, частично лишенные клеточной стенки, нежизнеспособные
- L-формы – утратившие клеточную стенку под влиянием антибиотиков. Маловирулентны, способны к размножению, длительной персистенции(длительное выживание в организме) в организме человека и к реверсии в исходные высоковирулентное состояние. Вызывают вялотекущие хронические инфекции.
- Микоплазмы – мелкие полиморфные Грам(-) бактерии
11. Жгутики и пили у бактерий, строение, функции.
Жгутики – нитевидные белковые образования, берущие начало от базофильных образований в цитоплазме бактерий и состоят из сократительного белка флагеллина. Являются органами движения микроорганизмов.
Классификация бактерий по характеру расположения и количеству жгутиков
Пили – их образуют только Гр(-) бактерии, они представляют своего рода ворсинки
Жгутики являются органами движения у многих бактерий, представляя собой очень тонкие (0,02—0,05 мкм) невидимые в обычный световой микроскоп нити, состоящие из сократительного белка флагеллина. По количеству и расположению жгутиков все подвижные бактерии подразделяются на следующие типы: а) монотрихи — имеют один жгутик на одном из концов клетки; б) амфитрихи - по одному жгутику на концах палочки; в) лофотрихи - пучок жгутиков на одном конце и г) перитрихи - большое количество жгутиков по периметру клетки. Диаметр жгутиков намного меньше разрешающей способности светового микроскопа, поэтому для их обнаружения пользуются или специальными методами окраски (предварительное протравливание мазка танином для того, чтобы вызвать набухание жгутиков, с последующей импрегнацией препарата), или изучают их при помощи электронного микроскопа жгутиков.
Наличие или отсутствие жгутиков у ряда бактерий является дифференциально-диагностическим признаком. Однако в связи со значительными трудностями обнаружения жгутиков и низкой воспроизводимостью метода их окраски, в практической работе наличие жгутиков оценивают путем изучения активной подвижности бактерий в живых неокрашенных препаратах.
Техника приготовления препаратов «раздавленная» и «висячая» капли для изучения подвижности микроорганизмов. Для изготовления препарата «висячей» капли взятую петлей или пастеровской пипеткой каплю суточной бульонной культуры наносят в центр покровного стекла, после чего накладывают его каплей вниз на стекло с лункой, края которой предварительно слегка смазывают вазелином. Капля не должна касаться краев лунки. При приготовлении «раздавленной» капли на предметное стекло наносят небольшую каплю культуры, которую покрывают покровным стеклом.
Микроскопию живых препаратов («висячая» или «раздавленная» капли) производят с сильной сухой (х40) или иммерсионной системой при несколько затемненном поле зрения (немного прикрыть диафрагму и опустить конденсор). Для изучения подвижности микробов можно пользоваться фазово-контрастной или темнопольной микроскопией.
У некоторых бактерий поверхность покрыта нежными ворсинками – пилями или фимбриями, которые могут быть обнаружены лишь при электронной микроскопии. Пили обеспечивают прилипание бактерий к питательным веществам или клеткам хозяина, а также принимают участие в половом процессе у бактерий – конъюгации.
12. Методы микроскопии (световая иммерсионная, люминесцентная, темнопольная, фазовоконтрастная, электронная).
Морфология микроорганизмов изучается с помощью микроскопа (рис. 3 –см. приложение). Разрешающая способность светового микроскопа (способность прибора «видеть» 2 точки раздельно) составляет 0,2 мкм (200 нм).
Особенностью микроскопического исследования в микробиологии является использование иммерсионной (immersio – погружать) системы. При этом виде микроскопии фронтальную линзу иммерсионного объектива с увеличением х90 (на нем имеется выгравированное кольцо черного цвета) погружают в каплю масла (кедрового, касторового или вазелинового), имеющего коэффициент преломления (1,51), близкий к показателю преломления стекла (1,52) во избежание потери света при переходе лучей из предметного стекла в воздушную среду (рис. 4). При микроскопии окрашенных объектов создают яркое освещение с помощью специального осветителя, зеркала, поднятого вверх конденсора и полностью открытой диафрагмы микроскопа. Неокрашенные объекты микроскопируют, ограничивая освещенность препарата, сужая диафрагму и опуская конденсор.
Микроскопия в темном поле расширяет разрешающую способность микроскопа до 0,02 мкм. Ее применяют для изучения неокрашенных живых микробов, их подвижности. Метод основан на освещении объекта косыми лучами света, которые, не попадая в объектив, остаются невидимыми для глаза. Поэтому поле зрения выглядит черным, а исследуемые микробные клетки, находящиеся в препарате, ярко светятся на темном фоне. Этот метод микроскопии требует специального конденсора с затемненной центральной частью, которая, задерживая центральную часть пучка лучей, пропускает лишь боковые косо направленные лучи.
Фазово-контрастная микроскопия. Изучение живых неокрашенных микробов затруднено в связи с их малой контрастностью. В видимом свете микроорганизмы прозрачны, мало отличаясь от окружающей среды. При прохождении света через микробную клетку за счет разницы в показателях преломления структур клетки происходит изменение фазы проходящих световых лучей, которое не улавливается глазом человека. Фазово-контрастное устройство переводит невидимые человеческому глазу фазовые изменения пучка света в контрастные (амплитудные), создавая контраст между неокрашенным микроорганизмом и окружающей средой. Устройство комплектуется специальными объективами с фазовыми кольцами, а также специальным фазовым конденсором с револьвером специальных кольцевых диафрагм для каждого объектива.
Люминесцентная (флюоресцентная) микроскопия. Люминесценция - это свечение объекта, возбуждаемое поглощенной световой энергией коротковолновой и ультрафиолетовой части спектра. Микробы обладают слабой первичной люминесценцией, поэтому на практике пользуются наведенной люминесценцией путем обработки объекта растворами люминесцирующих красителей — флюорохромов (акридин, аурамин, флюоресцеин, корифосфин, родамин и др.), которые светятся под влиянием ультрафиолетовых и коротковолновых синих лучей. Отдельные флюорохромы обладают избирательностью, связываясь с определенными клеточными структурами - ядром, оболочкой, цитоплазмой и включениями.
Конструктивные особенности люминесцентного микроскопа (рис.23) состоят в наличии мощной осветительной лампы (например, ртутно-кварцевой), а также специальных светофильтров. Возбуждающий люминесценцию синий фильтр, расположен за источником освещения, а «запирающий» фильтр желтого цвета на окуляре служит для отделения флюоресценции от падающего света.
Люминесцентная микроскопия имеет ряд преимуществ перед обычной световой микроскопией, в частности, возможностью исследования живых микроорганизмов, обнаружения их в материале в небольших количествах, наличием цветного изображения.
Электронная микроскопия. В электронном микроскопе вместо световых лучей используется поток электронов.
Длина волны электронных лучей во много раз короче длины световых лучей, что позволяет значительно увеличить разрешающую способность микроскопа, получить большее увеличение и рассматривать объекты, невидимые в световом микроскопе. Электронная микроскопия дает возможность изучать объекты величиной от 0,01 до 0,1 нм, применяя для изучения структур бактерий, вирусов и фагов.
На пути потока электронов в вакуумной среде помещены электромагнитные линзы, которые для электронных лучей являются фокусирующими, действуя подобно линзам для световых лучей. Исследуемый препарат, приготовленный на тончайшей пленке, помещают на пути потока электронов после их прохождения через конденсорную линзу, а затем через объективную и проекционные линзы. Картина микроскопируемого объекта отображается на флюоресцирующем экране вследствие неодинаковой проницаемости различных структур исследуемого объекта для электронов.
Разновидностью электронной микроскопии является сканирующая микроскопия, которая позволяет получить объемное изображение за счет управляемого пространственного перемещения пучка электронов.
13. Морфологические и тинкториальные свойства бактерий. Простые и сложные методы окраски бактерий.
Морфологические свойства бактерий. Бактерии — микроорганизмы, не имеющие оформленного ядра (прокариоты).
Бактерии имеют разнообразную форму и довольно сложную структуру, определяющую многообразие их функциональной деятельности. Для бактерий характерны четыре основные формы: сферическая (шаровидная), цилиндрическая (палочковидная), извитая и нитевидная.
Бактерии шаровидной формы — кокки — в зависимости от плоскости деления и расположения относительно друг друга отдельных особей подразделяются на микрококки (отдельно лежащие кокки), диплококки (парные кокки), стрептококки (цепочки кокков), стафилококки (имеющие вид виноградных гроздьев), тетракокки (образования из четырех кокков) и сарцины (пакеты из 8 или 16 кокков).
Палочковидные бактерии располагаются в виде одиночных клеток, дипло- или стрептобактерий.
Извитые формы бактерий — вибрионы и спириллы, а также спирохеты. Вибрионы имеют вид слегка изогнутых палочек, спириллы — извитую форму с несколькими спиральными завитками.
Размеры бактерий колеблются от 0,1 до 10 мкм. В состав бактериальной клетки входят капсула, клеточная стенка, цитоплаз-матическая мембрана и цитоплазма, в которой содержатся нук-леоид, рибосомы и включения. Некоторые бактерии снабжены жгутиками и ворсинками. Ряд бактерий образуют споры, которые располагаются терминально, субтерминально или центрально; превышая поперечный размер клетки, споры придают ей веретенообразную форму.
Методы окраски. Окраску мазка производят простыми или сложными методами. Простые заключаются в окраске препарата одним красителем; сложные методы (по Граму, Цилю — Нильсену и др.) включают последовательное использование нескольких красителей и имеют дифференциально-диагностическое значение. Отношение микроорганизмов к красителям расценивают как тинкториальные свойства. Существуют специальные методы окраски, которые используют для выявления жгутиков, клеточной стенки, нуклеоида и разных цитоплазматических включений.
При простых методах мазок окрашивают каким-либо одним красителем, используя красители анилинового ряда (основные или кислые). Если красящий ион (хромофор) — катион, то краситель обладает основными свойствами, если хромофор - анион, то краситель имеет кислые свойства. Кислые красители — эритрозин, кислый фуксин, эозин. Основные красители — генциановый фиолетовый, кристаллический фиолетовый, метиленовый синий, основной фуксин. Преимущественно для окраски микроорганизмов используют основные красители, которые более интенсивно связываются кислыми компонентами клетки. Из сухих красителей, продающихся в виде порошков, готовят насыщенные спиртовые растворы, а из них — водно-спиртовые, которые и служат для окрашивания микробных клеток. Микроорганизмы окрашивают, наливая краситель на поверхность мазка на определенное время. Окраску основным фуксином ведут в течение 2 мин, метиленовым синим — 5—7 мин. Затем мазок промывают водой до тех пор, пока стекающие струи воды не станут бесцветными, высушивают осторожным промоканием фильтровальной бумагой и микроскопируют в иммерсионной системе. Если мазок правильно окрашен и промыт, то поле зрения совершенно прозрачно, а клетки интенсивно окрашены.
Сложные методы окраски применяют для изучения структуры клетки и дифференциации микроорганизмов. Окрашенные мазки микроскопируют в иммерсионной системе. Последовательно нанести на препарат определенные красители, различающиеся по химическому составу и цвету, протравы, спирты, кислоту и др.
Существуют несколько основных окрасок: по Граму, по Цилю-Нельсону, по Ауески, Нейссера, Бури-Гинса.
14. Микроскопический метод исследования в диагностике инфекционных заболеваний и его практическое значение.
Бактериоскопический метод основан на изучении морфологических и тинкториальных особенностей бактерий в препаратах, приготовленных из материала от больного. Метод широко используется в диагностике чумы, туберкулеза, гонореи, сифилиса и ряда других заболеваний.
15. Физиология микробов. Питание и дыхание прокариотов. Механизмы поступления питательных веществ в прокариотическую клетку.
Дыхание (биологическое окисление, катаболизм, диссимиляция) – процесс освождения энергии живыми организмами в результате различных химических реакций. Аэробные бактерии, использующие энергию в результате окисления веществ кислородом воздуха, способны развиваться только при наличии кислорода. Анаэробные микроорганизмы могут развиваться при отсутствии кислорода, получая энергию в результате ферментативного расщепления органических веществ. Существуют также факультативные анаэробы, растущие как при наличии, так и при отсутствии кислорода. Определяют тип дыхания микроорганизмов посевом культуры бактерий уколом в высокий столбик агара. При этом аэробы вырастают в верхней части среды, факультативные анаэробы – по всей длине укола, анаэробы – в нижней части посева.
Типы питания. Микроорганизмы нуждаются в углеводе, азоте, сере, фосфоре, калии и других элементах. В зависимости от источников углерода для питания бактерии делятся на аутотрофы, использующие для построения своих клеток диоксид углерода С02 и другие неорганические соединения, и гетеротрофы, питающиеся за счет готовых органических соединений. Аутотрофными бактериями являются нитрифицирующие бактерии, находящиеся в почве; серобактерии, обитающие в воде с сероводородом; железобактерии, живущие в воде с закисным железом, и др.
Гетеротрофы, утилизирующие органические остатки отмерших организмов в окружающей среде, называются сапрофитами. Гетеротрофы, вызывающие заболевания у человека или животных, относят к патогенным и условно-патогенным. Среди патогенных микроорганизмов встречаются облигатные и факультативные паразиты (от греч. parasitos — нахлебник). Облигатные паразиты способны существовать только внутри клетки, например риккетсии, вирусы и некоторые простейшие.
В зависимости от окисляемого субстрата, называемого донором электронов или водорода, микроорганизмы делят на две группы. Микроорганизмы, использующие в качестве доноров водорода неорганические соединения, называют литотрофны-ми (от греч. lithos — камень), а микроорганизмы, использующие в качестве доноров водорода органические соединения, — органотрофами.
Учитывая источник энергии, среди бактерий различают фототрофы, т.е. фотосинтезирующие (например, сине-зеленые водоросли, использующие энергию света), и хемотрофы, нуждающиеся в химических источниках энергии.
Механизмы питания. Поступление различных веществ в бактериальную клетку зависит от величины и растворимости их молекул в липидах или воде, рН среды, концентрации веществ, различных факторов проницаемости мембран и др. Клеточная стенка пропускает небольшие молекулы и ионы, задерживая макромолекулы массой более 600 Д. Основным регулятором поступления веществ в клетку является цитоплазматическая мембрана. Условно можно выделить четыре механизма проникновения питательных веществ в бактериальную клетку: это простая диффузия, облегченная диффузия, активный транспорт, транслокация групп.
Наиболее простой механизм поступления веществ в клетку — простая диффузия, при которой перемещение веществ происходит вследствие разницы их концентрации по обе стороны цитоплазматической мембраны. Вещества проходят через липид-ную часть цитоплазматической мембраны (органические молекулы, лекарственные препараты) и реже по заполненным водой каналам в цитоплазматической мембране. Пассивная диффузия осуществляется без затраты энергии.
Облегченная диффузия происходит также в результате разницы концентрации веществ по обе стороны цитоплазматической мембраны. Однако этот процесс осуществляется с помощью молекул-переносчиков, локализующихся в цитоплазматической мембране и обладающих специфичностью. Каждый переносчик транспортирует через мембрану соответствующее вещество или передает другому компоненту цитоплазматической мембраны — собственно переносчику. Белками-переносчиками могут быть пермеазы, место синтеза которых — цитоплазматическая мембрана. Облегченная диффузия протекает без затраты энергии, вещества перемещаются от более высокой концентрации к более низкой.
Активный транспорт происходит с помощью пермеаз и направлен на перенос веществ от меньшей концентрации в сторону большей, т.е. как бы против течения, поэтому данный про цесс сопровождается затратой метаболической энергии (АТФ), образующейся в результате окислительно-восстановительных реакций в клетке.
Перенос (транслокация) групп сходен с активным транспортом, отличаясь тем, что переносимая молекула видоизменяется в процессе переноса, например фосфорилируется.
Выход веществ из клетки осуществляется за счет диффузии и при участии транспортных систем.
16. Особенности химического состава бактерий
Бактерии имеют сложное строение. В них представлены и неорганические и органические соединения. Наряду с простыми веществами имеются сложные компоненты
Вода(80-90% бактериальной массы, она может быть свободной и может быть связанная. Вода несет след. Функции –
1) Растворитель всех веществ
2) Вода – источник водородных и гидроксильных ионов
3) Вода также является дисперсионной средой для протекания реакций в клетке
4) Связанная вода придает большую связанность(резистентность) в спорах например к замерзанию и испарению)
v Минеральные вещества – фосфор, медь, железо, калий, кальций, натрий.
1) Входят в структуры клетки.
2) Обеспечивают осмотическое давление
3) Определяют активность фермента
v Нуклеиновые кислоты представлены
1) ДНК(двухцепочечные и несет хранение генетической информации) и
2) РНК(одноцепочечная, представлена информационной, транспортой и рибосомальной и обеспечивает синтез специфического белка) Особенностью ДНК является что сумма оснований Г+Ц у позвоночных 40%, а у бактерий эта сумма варьирует у Гр(+) = 70-80%, а у Гр(-)=28-30%
v Белки у бактерий представлены простыми белками протеинами и сложными соединениями – протеидами – сложное соединения белков. Белки составляют 50% сухого остатка и могут содержать необычные аминокислоты. Белки несут следующие функции –
1) структурную
2) образуют ферментные системы
3) образуют двигательную систему
4) гидрофильность бактерий(смачиваемость)
5) тинкториальные свойства(особенности окраски)
6) специфичность(антигенное свойство)
7) токсичность
8) электрический заряд бактерий, благодаря которому бактерии способны к электрофорезу, т.е. движению в электрическом поле
v Углеводы – представлены моносахарами, дисахарами и полисахарами. Особенностью их является то, что часть углеводов встречается только у бактерий. У Гр(+) – тейхоловые кислоты. Углеводы играют важную роль –
1) Пластический материал
2) Один из основных источников энергии
3) Специфичность
4) Токсичность
v Липиды – могут быть в виде свободных соединений и в комплексе с белками и углеводами. Липиды представлены нейтральными жирами, фосфолипидами и имеются сложные соединения липидов – воска. Воска – это жиро подобные соединения, состоящие из птиацерола(спирта), аминокислот и низшие жирные кислоты. Чем больше восков, тем более патогенная бактерия. Отличаются липиды наличием необычных соединений. У Гр(-) имеется липид А, имеются необычные фосфолипиды, например аминоацил производные. Липиды несут следующие функции –
1) Структурная роль
2) Предают прочность этим структурам
3) Липиды определяют болезнетворность
4) Играют энергетическую роль
5) Определяют специфичность, с липидами связана устойчивость к антибиотикам и липиды определяют резистентность к кислотам
17. Классификация бактерий по типам питания. Механизмы питания бактерий.
Классификация бактерий по способу питания
1. По источнику углерода
2. По источнику энергии
3. По донору электронов
Стафилококк – хесоорагногетеротроф.
Питание бактерий – это поступление веществ в бактериальную клетку. Поступление веществ в бактериальную клетку контролирует цитоплазматическая мембрана. Она полупроницаема и обладает избирательной проницаемостью. Поступление веществ в клетку определяется следующими механизмами –
18. Принципы и методы выделения чистых культур аэробных бактерий.
Методы выделения чистых культур аэробных микроорганизмов подразделяются на 2 группы:
а) методы, основанные на принципе механического разобщения микроорганизмов:
б) методы, основанные на биологических свойствах микроорганизмов:
Выделение чистых культур бактерий включает 3 этапа
Выделение чистых культур бактерий обычно занимает 2-3 дня, медленно растущих (микобактерии туберкулеза) – 4-6 недель и более.
19. Принципы и методы выделения чистых культур анаэробных бактерий.
Для культивирования анаэробов необходимо создать с помощью физических, химических и биологических методов условия анаэробиоза - пониженного содержания кислорода в среде и окружающем ее пространстве.
Физические методы:
Химические методы основаны на поглощении кислорода воздуха в анаэростате или эксикаторе такими веществами, как пирогаллол или гидросульфит натрия;
Биологические методы основаны на совместном выращивании анаэробов со строгими аэробами. На одну половину чашки Петри с МПА засевают культуру аэробов, на другую - анаэробов. Края чашки заклеивают пластилином или заливают расплавленным парафином, посев ставят в термостат. Сначала вырастают аэробы, потом (через 3-4 дня) - анаэробы.
Комбинированные методы основаны на сочетании физических, химических и биологических методов создания анаэробиоза.
20. Дыхание бактерий. Классификация бактерий по типам дыхания. Культивирование анаэробов. (вопрос 19)
Дыхание (биологическое окисление, катаболизм, диссимиляция) – процесс освождения энергии живыми организмами в результате различных химических реакций. Аэробные бактерии, использующие энергию в результате окисления веществ кислородом воздуха, способны развиваться только при наличии кислорода. Анаэробные микроорганизмы могут развиваться при отсутствии кислорода, получая энергию в результате ферментативного расщепления органических веществ. Существуют также факультативные анаэробы, растущие как при наличии, так и при отсутствии кислорода. Определяют тип дыхания микроорганизмов посевом культуры бактерий уколом в высокий столбик агара. При этом аэробы вырастают в верхней части среды, факультативные анаэробы – по всей длине укола, анаэробы – в нижней части посева.
21. Искусственные питательные среды, их классификация. Требования, предъявляемые к питательным средам.
Питательные среды для бактерий. Используют для получения чистых культур
Питательные среды по происхождению бывают
По составу питательные среды могут быть
По назначению питательные среды могут быть
Среда Эндо – содержит МПА, 1% лактозы и индикатор фуксин, обесцвеченные фуксидом натрия, используется для дифференцировки бактерий кишечной группы по отношению к лактозе. Если лактоза расщепляется, образуется кислота, в которой фуксин в присутствии кислоты восстанавливается, образуются колонии красного цвета. Если лактоза не расщепляется то кислота не образуется, колонии бесцветные.
Параметры питательных сред.
1. Питательные среды должны иметь определенную концентрацию ионов водорода. Для большинства бактерий ph близкая к 7.
2. Питательная среда должна иметь воду и определенное осмотическое давление
3. В питательной среде должны быть источники углерода.
4. Питательная среда должна содержать серу и азот
5. Должен быть или его должно не быть Кислород.
6. Химические элементы. Обычно эти элементы добавляют в виде солей.
7. Питательная среда должна иметь оптимальную температуру. Температура создается в термостатах
8. По отношению к температуре бактерии подразделяются
- тепофилы(оптимальная температура 40-80 градусов)
- психофилы или криофилы(они развиваются при температуре ниже 20)
- мезофиллы (20-42 градуса)
Питательная среда должна содержат факторы роста. Факторы роста – это вещества, которые вводят в бактериальную клетку, эти вещества бактерия сама не способна синтезировать. К таким факторам роста – пурины и пиримидины, витамины.
22. Ферменты бактерий, классификация. Методы определения ферментативной активности бактерий.
Ферменты микроорганизмов являются белками - катализаторами химических реакций, происходящих в организме. В микробиологической практике определение ферментов используют для идентификации микроорганизмов, т.к. каждый микробный вид характеризуется определенной биохимической активностью.
Для определения протеолитической активности микроорганизмы засевают в столбик желатина уколом, наблюдая через 3—5 дней разжижение желатина. При разложении белка некоторыми бактериями могут выделяться индол, сероводород, аммиак. Для их определения служат специальные индикаторные бумажки, которые помещают между горлышком и ватной пробкой в пробирку с МПБ или (и) пептонной водой, засеянными изучаемыми микроорганизмами. Индол (продукт разложения триптофана) окрашивает в розовый цвет полоску бумаги, пропитанной насыщенным раствором щавелевой кислоты. В присутствии сероводорода полоска бумаги, пропитанная раствором ацетата свинца, чернеет. Для определения аммиака используют лакмусовую бумажку.
Важным признаком многих микроорганизмов является способность разлагать определенные углеводы с образованием кислот и газообразных продуктов. Для выявления этого свойства бактерий используют среды Гисса, содержащие различные углеводы (глюкозу, сахарозу, мальтозу, лактозу и др.) и индикаторы (например, реактив Андреде, меняющий свой цвет от бледно-желтого до красного в интервале рН 7,2—6,5), поэтому эти среды нередко называют «пестрым» или «цветным» рядом. Для обнаружения газообразования в жидкие среды опускают стеклянные поплавки или используют полужидкие среды. Сбраживание лактозы в молочных средах определяют по их свертыванию или изменению цвета лакмусового индикатора, а также при пептонизации.
При идентификации многих микроорганизмов используют реакцию Фогеса — Проскауэра на ацетоин (промежуточное соединение при образовании бутандиола из пировиноградной кислоты). Для этого к 3 мл культуры микроорганизмов на среде Кларка добавляют 1 мл свежеприготовленного 10% спиртового раствора α-нафтола и 1 мл 20% водного раствора гидроксида калия. При наличии ацетоина СНзСНОН СОСН3 жидкость приобретает красную окраску, что свидетельствует о бутандиоловом брожении.
Каталаза - фермент, катализирующий реакцию разложения перекиси водорода с образованием воды и кислорода, содержат аэробы и факультативные анаэробы, но не анаэробы. Для обнаружения фермента небольшое количество исследуемой культуры эмульгируют в капле перекиси водорода, наблюдая выделение пузырьков кислорода.
Определение цитохромоксидазы (фермента, обеспечивающего перенос электронов на атом кислорода в процессе анаэробного дыхания) проводят при дифференциации энтеробактерий, применяя смесь 1% спиртового раствора β–нафтола и 1% водного раствора N-диметил-парафенилендиамина дигидрохлорида, смешанных в соотношении 2:3. На полоску фильтровальной бумаги, смоченной этим реактивом, наносят петлей культуру микроорганизмов. При наличии фермента через 2-5 мин полоска окрашивается в синий цвет.
Важным биохимическим свойством у ряда микробов является их способность восстанавливать нитраты в нитриты. Для определения нитритов используют реактив Грисса, который готовят из 2 растворов: (первый - 0,5 г сульфаниловой кислоты, растворенной в 30 мл ледяной уксусной кислоты, с последующим добавлением 100 мл воды; второй - 0,1 г нафтиламина, растворенного в 100 мл кипящей воды, с последующим добавлением 30 мл ледяной уксусной кислоты). Оба раствора смешивают в равных объемах, 0,1 мл реактива добавляют в культуру бактерий. Окрашивание культуры в красный цвет указывает на присутствие нитритов.
Гидролиз мочевины определяют по выделению аммиака (лакмусовая бумажка) и изменению реакции среды в щелочную сторону (с pH 7,2 до 8,8, при этом среда приобретает пурпурно-красный цвет).
23. Характеристика процессов роста и размножения у бактерий. Фазы развития бактериальной популяции.
Жизнедеятельность бактерий характеризуется ростом — формированием структурно-функциональных компонентов клетки и увеличением самой бактериальной клетки, а также размножением — самовоспроизведением, приводящим к увеличению количества бактериальных клеток в популяции.
Бактерии размножаются путем бинарного деления пополам, реже путем почкования. Актиномицеты, как и грибы, могут размножаться спорами. Актиномицеты, являясь ветвящимися бактериями, размножаются путем фрагментации нитевидных клеток. Грамположительные бактерии делятся путем врастания синтезирующихся перегородок деления внутрь клетки, а грамотрицательные — путем перетяжки, в результате образования гантелевид-ных фигур, из которых образуются две одинаковые клетки.
Делению клеток предшествует репликация бактериальной хромосомы по полуконсервативному типу (двуспиральная цепь ДНК раскрывается и каждая нить достраивается комплементарной нитью), приводящая к удвоению молекул ДНК бактериального ядра — нуклеоида.
Репликация ДНК происходит в три этапа: инициация, элонгация, или рост цепи, и терминация.
Размножение бактерий в жидкой питательной среде. Бактерии, засеянные в определенный, не изменяющийся объем питательной среды, размножаясь, потребляют питательные элементы, что приводит в дальнейшем к истощению питательной среды и прекращению роста бактерий. Культивирование бактерий в такой системе называют периодическим культивированием, а культуру — периодической. Если же условия культивирования поддерживаются путем непрерывной подачи свежей питательной среды и оттока такого же объема культуральной жидкости, то такое культивирование называется непрерывным, а культура — непрерывной.
При выращивании бактерий на жидкой питательной среде наблюдается придонный, диффузный или поверхностный (в виде пленки) рост культуры. Рост периодической культуры бактерий, выращиваемых на жидкой питательной среде, подразделяют на несколько фаз, или периодов:
1. лаг-фаза;
2. фаза логарифмического роста;
3. фаза стационарного роста, или максимальной концентрации
бактерий;
4. фаза гибели бактерий.
Эти фазы можно изобразить графически в виде отрезков кривой размножения бактерий, отражающей зависимость логарифма числа живых клеток от времени их культивирования.
Лаг-фаза — период между посевом бактерий и началом размножения. Продолжительность лаг-фазы в среднем 4—5 ч. Бактерии при этом увеличиваются в размерах и готовятся к делению; нарастает количество нуклеиновых кислот, белка и других компонентов.
Фаза логарифмического (экспоненциального) роста является периодом интенсивного деления бактерий. Продолжительность ее около 5— 6 ч. При оптимальных условиях роста бактерии могут делиться каждые 20—40 мин. Во время этой фазы бактерии наиболее ранимы, что объясняется высокой чувствительностью компонентов метаболизма интенсивно растущей клетки к ингибиторам синтеза белка, нуклеиновых кислот и др.
Затем наступает фаза стационарного роста, при которой количество жизнеспособных клеток остается без изменений, составляя максимальный уровень (М-концентрация). Ее продолжительность выражается в часах и колеблется в зависимости от вида бактерий, их особенностей и культивирования.
Завершает процесс роста бактерий фаза гибели, характеризующаяся отмиранием бактерий в условиях истощения источников питательной среды и накопления в ней продуктов метаболизма бактерий. Продолжительность ее колеблется от 10 ч до нескольких недель. Интенсивность роста и размножения бактерий зависит от многих факторов, в том числе оптимального состава питательной среды, окислительно-восстановительного потенциала, рН, температуры и др.
Размножение бактерий на плотной питательной среде. Бактерии, растущие на плотных питательных средах, образуют изолированные колонии округлой формы с ровными или неровными краями (S- и R-формы), различной консистенции и цвета, зависящего от пигмента бактерий.
Пигменты, растворимые в воде, диффундируют в питательную среду и окрашивают её. Другая группа пигментов нерастворима в воде, но растворима в органических растворителях. И, наконец, существуют пигменты, не растворимые ни в воде, ни в органических соединениях.
Наиболее распространены среди микроорганизмов такие пигменты, как каротины, ксантофиллы и меланины. Меланины являются нерастворимыми пигментами черного, коричневого или красного цвета, синтезирующимися из фенольных соединений. Меланины наряду с каталазой, супероксидцисмутазой и пероксидазами защищают микроорганизмы от воздействия токсичных перекисных радикалов кислорода. Многие пигменты обладают антимикробным, антибиотикоподобным действием.
24. Этапы бактериологического метода исследования. Способы идентификации выделенной культуры.
I. Окончание бактериологического исследования по выделению аэробов из смеси бактерий. Проводится идентификация бактерий – определение их видовой принадлежности на основании изучения наиболее важных фенотипических свойств данного микроорганизма. К основным видовым признакам бактерий относятся:
В последние годы для видовой идентификации бактерий используются биохимические методы (газожидкостная хроматография с целью идентификации бактерий по составу жирных кислот, а также молекулярно-генетические методы, в том числе рестрикционный анализ, гибридизация ДНК, и наиболее часто -полимеразная цепная реакция).
25. Способы культивирование аэробных и анаэробных бактерий.
Для культивирования бактерий в лабораторных условиях применяют искусственные питательные среды различного состава (рис. 24, см. приложение). Питательные среды используются для получения и сохранения чистых культур микроорганизмов, изучения особенностей их морфологических, биохимических и других свойств.
В микробиологической практике для культивирования многих видов бактерий широко применяются простые питательные среды, являющиеся также основой для приготовления ряда сложных питательных сред: сахарных, сывороточных, кровяных и др.
Методы культивирования анаэробов.
Для культивирования анаэробов необходимо понизить окислительно-восстановительный потенциал среды, создать условия анаэробиоза, т. е. пониженного содержания кислорода в среде и окружающем ее пространстве. Это достигается применением физических, химических и биологических методов.
Физические методы. Основаны на выращивании микроорганизмов в безвоздушной среде, что достигается:
1) посевом в среды, содержащие редуцирующие и легко окисляемые вещества;
2) посевом микроорганизмов в глубину плотных питательных сред;
3) механическим удалением воздуха из сосудов, в которых выращиваются анаэробные микроорганизмы;
4) заменой воздуха в сосудах каким-либо индифферентным газом.
В качестве редуцирующих веществ обычно используют кусочки (около 0,5 г) животных или растительных тканей (печень, мозг, почки, селезенка, кровь, картофель, вата). Эти ткани связывают растворенный в среде кислород и адсорбируют бактерии. Чтобы уменьшить содержание кислорода в питательной среде, ее перед посевом кипятят 10—15 мин, а затем быстро охлаждают и заливают сверху небольшим количеством стерильного вазелинового масла. Высота слоя масла в пробирке около 1 см.
В качестве легко окисляемых веществ используют глюкозу, лактозу и муравьинокислый натрий.
Лучшей жидкой питательной средой с редуцирующими веществами является среда Китта — Тароцци, которая используется с успехом для накопления анаэробов при первичном посеве из исследуемого материала и для поддержания роста выделенной чистой культуры анаэробов.
Посев микроорганизмов в глубину плотных сред производят по способу Виньяль — Вейона, который состоит в механической защите посевов анаэробов от кислорода воздуха. Берут стеклянную трубку длиной 30 см и диаметром 3—6 мм. Один конец трубки вытягивают в капилляр в виде пастеровской пипетки, а у другого конца делают перетяжку. В оставшийся широкий конец трубки вставляют ватную пробку. В пробирки с расплавленным и охлажденным до 50°С питательным агаром засевают исследуемый материал. Затем насасывают засеянный агар в стерильные трубки Виньяль — Вейона. Капиллярный конец трубки запаивают в пламени горелки и трубки помещают в термостат. Так создаются благоприятные условия для роста самых строгих анаэробов. Для выделения отдельной колонии трубку надрезают напильником, соблюдая правила асептики, на уровне колонии, ломают, а колонию захватывают стерильной петлей и переносят в пробирку с питательной средой для дальнейшего выращивания и изучения в чистом виде.
Удаление воздуха производят путем его механического откачивания из специальных приборов — анаэроста-тов, в которые помещают чашки с посевом анаэробов. Переносный анаэростат представляет собой толстостенный металлический цилиндр с хорошо притертой крышкой (с резиновой прокладкой), снабженный отводящим краном и вакуумметром. После размещения засеянных чашек или пробирок воздух из анаэростата удаляют с помощью вакуумного насоса.
Замену воздуха индифферентным газом (азотом, водородом, аргоном, углекислым газом) можно производить в тех же анаэростатах путем вытеснения его газом из баллона.
Химические методы. Основаны на поглощении кислорода воздуха в герметически закрытом сосуде (анаэро-стате, эксикаторе) такими веществами, как пирогаллол или гидросульфит натрия Na2S204.
Биологические методы. Основаны на совместном выращивании анаэробов со строгими аэробами. Для этого из застывшей агаровой пластинки по диаметру чашки вырезают стерильным скальпелем полоску агара шириной около 1 см. Получается два агаровых полудиска в одной чашке. На одну сторону агаровой пластинки засевают аэроб, например часто используют S. aureus или Serratia marcescens. На другую сторону засевают анаэроб. Края чашки заклеивают пластилином или заливают расплавленным парафином и помещают в термостат. При наличии подходящих условий в чашке начнут размножаться аэробы. После того, как весь кислород в пространстве чашки будет ими использован, начнется рост анаэробов (через 3—4 сут). В целях сокращения воздушного пространства в чашке питательную среду наливают возможно более толстым слоем.
Комбинированные методы. Основаны на сочетании физических, химических и биологических методов создания анаэробиоза.
26. Бактериологический метод исследования в диагностике инфекционных заболеваний.
Культуральный (бактериологический) метод исследования - совокупность способов, направленных на выделение и идентификацию чистых культур микроорганизмов (бактерий) с помощью культивирования на питательных средах.
Чистая культура - совокупность микроорганизмов одного вида. Чаще всего чистую культуру получают путем отбора и культивирования изолированной колонии (потомство одной микробной клетки).
Этапы метода:
1. Забор материала для исследования.
2. Выделение чистой культуры и ее идентификация.
3. Заключение.
Забор материала для исследования. Вид исследуемого материала зависит от цели исследования (диагностика - от больного; эпиданализ - из внешней среды, продуктов питания, больного и (или) бактерионосителя).
Выделение чистой культуры. Включает 3 или 4 этапа:
1. Посев материала (после предварительной микроскопии) на чашку с плотной питательной средой (лучше дифференциально-диагностической или селективной) с целью получения изолированных колоний. Производят его чаще всего методом механического разобщения. В некоторых случаях (например, кровь) материал предварительно засевают в жидкую среду обогащения с последующим пересевом на чашку с агаровой средой. Иногда до посева проводят селективную обработку материала (с учетом свойств выделяемого микроорганизма; например, обработка кислотой или щелочью для выделения устойчивых бактерий). Культивируют при температуре 37°С в течение 18-24 часов. Время культивирования для разных видов бактерий может колебаться.
2(3):а) изучение колоний на чашке с агаром (культуральные признаки), отбор наиболее типичных; б) приготовление мазков из этих колоний с окраской (по Граму или другими методами); а) отсев остатка исследованной колонии на среду накопления и выращивание в термостате при оптимальной температуре.
3(4). Изучение чистоты культуры, полученной на среде накопления. С этой
целью готовят мазок, окрашивают (чаще по Граму), микроскопически изучают
морфологическую и тинкториальную однородность (в разных полях зрения).
4(5). Идентификация чистой культуры.
Заключение. По совокупности признаков в сравнении со свойствами эталонных (типовых) штаммов указывается вид выделенного из материала микроорганизма.
Оценка метода:
достоинства: относительно высокая чувствительность и точность, возможность определить численность микробов в исследуемом материале, а также чувствительность к антибиотикам; недостатки: относительная длительность, метод дорогостоящий.
27. Действие физических и химических факторов на микроорганизмы. Понятие о стерилизации, дезинфекции, асептике и антисептике.
Влияние температуры. Различные группы микроорганизмов развиваются при определенных диапазонах температур. Бактерии, растущие при низкой температуре, называют психрофилами, при средней (около 37 °С) — мезофилами, при высокой — термофилами.
К психрофильным микроорганизмам относится большая группа сапрофитов — обитателей почвы, морей, пресных водоемов и сточных вод (железобактерии, псевдомонады, светящиеся бактерии, бациллы). Некоторые из них могут вызывать порчу продуктов питания на холоде. Способностью расти при низких температурах обладают и некоторые патогенные бактерии (возбудитель псевдотуберкулеза размножается при температуре 4 °С). В зависимости от температуры культивирования свойства бактерий меняются. Интервал температур, при котором возможен рост психрофильных бактерий, колеблется от -10 до 40 °С, а температурный оптимум — от 15 до 40 °С, приближаясь к температурному оптимуму мезофильных бактерий.
Мезофилы включают основную группу патогенных и условно-патогенных бактерий. Они растут в диапазоне температур 10— 47 °С; оптимум роста для большинства из них 37 °С.
При более высоких температурах (от 40 до 90 °С) развиваются термофильные бактерии. На дне океана в горячих сульфидных водах живут бактерии, развивающиеся при температуре 250—300 °С и давлении 262 атм.
Термофилы обитают в горячих источниках, участвуют в процессах самонагревания навоза, зерна, сена. Наличие большого количества термофилов в почве свидетельствует о ее загрязненности навозом и компостом. Поскольку навоз наиболее богат термофилами, их рассматривают как показатель загрязненности почвы.
Хорошо выдерживают микроорганизмы действие низких температур. Поэтому их можно долго хранить в замороженном состоянии, в том числе при температуре жидкого газа (—173 °С).
Высушивание. Обезвоживание вызывает нарушение функций большинства микроорганизмов. Наиболее чувствительны к высушиванию патогенные микроорганизмы (возбудители гонореи, менингита, холеры, брюшного тифа, дизентерии и др.). Более устойчивыми являются микроорганизмы, защищенные слизью мокроты.
Высушивание под вакуумом из замороженного состояния — лиофилизацию — используют для продления жизнеспособности, консервирования микроорганизмов. Лиофилизированные культуры микроорганизмов и иммунобиологические препараты длительно (в течение нескольких лет) сохраняются, не изменяя своих первоначальных свойств.
Действие излучения. Неионизирующее излучение — ультрафиолетовые и инфракрасные лучи солнечного света, а также ионизирующее излучение — гамма-излучение радиоактивных веществ и электроны высоких энергий губительно действуют на микроорганизмы через короткий промежуток времени. УФ-лучи применяют для обеззараживания воздуха и различных предметов в больницах, родильных домах, микробиологических лабораториях. С этой целью используют бактерицидные лампы УФ-излучения с длиной волны 200—450 нм.
Ионизирующее излучение применяют для стерилизации одноразовой пластиковой микробиологической посуды, питательных сред, перевязочных материалов, лекарственных препаратов и др. Однако имеются бактерии, устойчивые к действию ионизирующих излучений, например Micrococcus radiodurans была выделена из ядерного реактора.
Действие химических веществ. Химические вещества могут оказывать различное действие на микроорганизмы: служить источниками питания; не оказывать какого-либо влияния; стимулировать или подавлять рост. Химические вещества, уничтожающие микроорганизмы в окружающей среде, называются дезинфицирующими. Антимикробные химические вещества могут обладать бактерицидным, вирулицидным, фунгицидным действием и т.д.
Химические вещества, используемые для дезинфекции, относятся к различным группам, среди которых наиболее широко представлены вещества, относящиеся к хлор-, йод- и бромсодержащим соединениям и окислителям.
Антимикробным действием обладают также кислоты и их соли (оксолиновая, салициловая, борная); щелочи (аммиак и его соли,
Асептика – система мероприятий, исключающая попадание микробов из внешней среды в организм человека при лечебных и диагностических процедурах, а также в материал для исследования, питательные среды и культуры микроорганизмов при выполнении микробиологических исследований. Асептика основывается на стерилизации инструментов и материалов, обработке рук медицинских работников, соблюдении санитарно-гигиенических правил и приемов работы.
Антисептика - комплекс лечебно-профилактических мероприятий, целью которых является уничтожение микроорганизмов, способных вызвать инфекционный процесс на поврежденных или неповрежденных участках кожи и слизистых оболочек. В качестве антисептических средств используются следующие антимикробные препараты: 70% этиловый спирт, 5% раствор йода,0,5-2,0% раствор хлорамина, 0,1% раствор перманганата калия, 0,5-1,0% раствор формалина, 1-2% растворы метиленевого синего или бриллиантового зеленого и т.д.
Дезинфекция – обеззараживание объектов внешней среды с уничтожением патогенных для человека и животных микроорганизмов с помощью химических антимикробных веществ. К дезинфицирующим препаратам относятся разнообразные по своей химической природе антисептические вещества: фенолы и их производные, тяжелые металлы, некоторые кислоты, спирты и др. В лабораторной практике в качестве дезинфицирующих средств используются растворы карболовой кислоты или фенола (3-5%), лизола (4%), хлорной извести (10-20%), хлорамина (1-3%), 3-6% перекиси водорода и др.
Изделия медицинского назначения, используемые при проведении гнойных операций или оперативных манипуляций у инфекционного больного (табл. 1), перед предстерилизационной обработкой и стерилизацией подвергают дезинфекции, не вынося из отделения, одним из вышеуказанных режимов.
При дезинфекции изделий медицинского назначения дезинфицирующими растворами проводят предварительное ополаскивание в таком же дезинфицирующем растворе, но в другой ёмкости, т. к. при контакте с кровью и другими белковыми веществами активность раствора падает.
Изделия из коррозионно-нестойких металлов обеззараживают преимущественно кипячением. Перед кипячением изделия, загрязнённые кровью, промывают водой. Смывные воды обеззараживают.
Стерилизация (обеспложивание) - это полное уничтожение вегетативных форм микроорганизмов и их спор в различных материалах. Методы стерилизации и применяемая для этого аппаратура отражены в таблице 2.
28. Методы контроля эффективности стерилизации и дезинфекции
Контроль работы автоклава осуществляется физическими, химическими и биологическими методами. Температуру пара измеряют максимальным термометром, который помещают в автоклав вместе со стерилизуемым материалом. Используются также химические вещества с определенной температурой плавления (бензонафтол – 1100 С, бензойная кислота – 1200 С и др.), в смеси с красителем (фуксин, сафранин), помещаемые в стеклянные трубочки, которые затем ставят в автоклав. После плавления эти вещества равномерно окрашиваются красителями. Для бактериологического контроля стерилизации берут полоски фильтровальной бумаги, смоченные тест-культурой споровых бактерий. Эти тесты после автоклавирования засевают на питательные среды и по отсутствию роста бацилл судят об эффективности стерилизации.
29. Способы и методы стерилизации, аппаратура. Контроль стерилизации.
Стерилизация предполагает полную инактивацию микробов в объектах, подвергающихся обработке.
Существует три основных метода стерилизации: тепловой, лучевой, химической.
Тепловая стерилизация основана на чувствительности микробов к высокой температуре. При 60 "С и наличии воды происходит денатурация белка, деградация нуклеиновых кислот, липидов, вследствие чего вегетативные формы микробов погибают. Споры, содержащие очень большое количество воды в связанном состоянии и обладающие плотными оболочками, инактивируются при 160—170 °С.
Для тепловой стерилизации применяют, в основном, сухой жар и пар под давлением.
Стерилизацию сухим жаром осуществляют в воздушных стерилизаторах (прежнее название — «сухожаровые шкафы или печи Пастера»). Воздушный стерилизатор представляет собой металлический плотно закрывающийся шкаф, нагревающийся с помощью электричества и снабженный термометром. Обеззараживание материала в нем производят, как правило, при 160 °С в течение 120 мин. Однако возможны и другие режимы: 200 °С - 30 мин, 180 "С - 40 мин.
Стерилизуют сухим жаром лабораторную посуду и другие изделия из стекла, инструменты, силиконовую резину, т. е. объекты, которые не теряют своих качеств при высокой температуре.
Большая часть стерилизуемых предметов не выдерживает подобной обработки, и поэтому их обеззараживают в паровых стерилизаторах.
Обработка паром под давлением в паровых стерилизаторах (старое название — «автоклавы») является наиболее универсальным методом стерилизации.
Паровой стерилизатор (существует множество его модификаций) — металлический цилиндр с прочными стенками, герметически закрывающийся, состоящий из водопаровой и стерилизующей камер. Аппарат снабжен манометром, термометром и другими контрольно-измерительными приборами. В автоклаве создается повышенное давление, что приводит к увеличению температуры кипения.
Поскольку кроме высокой температуры на микробы оказывает воздействие и пар, споры погибают уже при 120 °С. Наиболее распространенный режим работы парового стерилизатора: 2 атм — 121 °С — 15—20 мин. Время стерилизации уменьшается при повышении атмосферного давления, а следовательно, и температуры кипения (136 °С — 5 мин). Микробы погибают за несколько секунд, но обработку материала производят в течение большего времени, так как, во-первых, высокая температура должна быть и внутри стерилизуемого материала и, во-вторых, существует так называемое поле безопасности (рассчитанное на небольшую неисправность автоклава).
Стерилизуют в автоклаве бульшую часть предметов: перевязочный материал, белье, коррозионно-устойчивые металлические инструменты, питательные среды, растворы, инфекционный материал и т. д.
Одной из разновидностей тепловой стерилизации является дробная стерилизация, которую применяют для обработки материалов, не выдерживающих температуру выше 100 °С, например, для стерилизации питательных сред с углеводами, желатина. Их нагревают в водяной бане при 80 °С в течение 30—60 мин.
В настоящее время применяют еще один метод тепловой стерилизации, предназначенный специально для молока — ультравысокотемпературный (УВТ): молоко обрабатывают в течение нескольких секунд при 130—150 °С.
Химическая стерилизация предполагает использование токсичных газов: оксида этилена, смеси ОБ (смеси оксида этилена и бромистого метила в весовом соотношении 1:2,5) и формальдегида. Эти вещества являются ал-килирующими агентами, их способность в присутствии воды инактивировать активные группы в ферментах, других белках, ДНК и РНК приводит к гибели микроорганизмов.
Стерилизация газами осуществляется в присутствии пара при температуре от 18 до 80 °С в специальных камерах. В больницах используют формальдегид, в промышленных условиях — оксид этилена и смесь ОБ.
Перед химической стерилизацией все изделия, подлежащие обработке, должны быть высушены.
Этот вид стерилизации небезопасен для персонала, для окружающей среды и для пациентов, пользующихся простерилизованными предметами (большинство стерилизующих агентов остается на предметах).
Однако существуют объекты, которые могут быть повреждены нагреванием, например, оптические приборы, радио- и электронная аппаратура, предметы из нетермостойких полимеров, питательные среды с белком и т. п., для которых пригодна только химическая стерилизация. Например, космические корабли и спутники, укомплектованные точной аппаратурой, для их деконтаминации обезвреживают газовой смесью (оксид этилена и бромистого метила).
В последнее время в связи с широким распространением в медицинской практике изделий из термолабильных материалов, снабженных оптическими устройствами, например эндоскопов, стали применять обезвреживание с помощью химических растворов. После очистки и дезинфекции прибор помещают на определенное время (от 45 до 60 мин) в стерилизующий раствор, затем прибор должен быть отмыт стерильной водой. Для стерилизации и отмывки используют стерильные емкости с крышками. Простерилизованное и отмытое от стерилизующего раствора изделие высушивают стерильными салфетками и помещают в стерильную емкость. Все манипуляции проводят в асептических условиях и в стерильных перчатках. Хранят эти изделия не более 3 суток.
Лучевая стерилизация осуществляется либо с помощью гамма-излучения, либо с помощью ускоренных электронов.
Лучевая стерилизация является альтернативой газовой стерилизации в промышленных условиях, и применяют ее также в тех случаях, когда стерилизуемые предметы не выдерживают высокой температуры. Лучевая стерилизация позволяет обрабатывать сразу большое количество предметов (например, одноразовых шприцев, систем для переливания крови). Благодаря возможности широкомасштабной стерилизации, применение этого метода вполне оправданно, несмотря на его экологическую опасность и неэкономичность.
Еще одним способом стерилизации является фильтрование. Фильтрование с помощью различных фильтров (керамических, асбестовых, стеклянных), а в особенности мембранных ультрафильтров из коллоидных растворов нитроцеллюкозы или других веществ позволяет освободить жидкости (сыворотку крови, лекарства) от бактерий, грибов, простейших и даже вирусов. Для ускорения процесса фильтрации обычно создают повышенное давление в емкости с фильтруемой жидкостью или пониженное давление в емкости с фильтратом.
В настоящее время все более широкое применение находят современные методы стерилизации, созданные на основе новых технологий, с использованием плазмы, озона.
30. Физические и химические факторы деконтаминации. Понятие об антисептиках, дезинфектантах. Оборудование для дезинфекции и стерилизации, используемое в практическом здравоохранении
Таблица 1. Дезинфекция предметов медицинского назначения
Инфекции |
||
Гнойные заболевания, кишечные и капельные инфекции бактериальной этиологии. |
Туберкулез |
Вирусные гепатиты
|
1.Кипячение в дистиллированной воде - 30 мин
|
1.Кипячение в дистиллированной воде - 30 мин |
1.Кипячение в дистиллированной воде - 30 мин. |
2. Кипячение с гидрокарбонатом натрия 2% -15 мин |
2.Кипячение с гидрокарбонатом натрия 2 % -15 мин |
2.Кипячение с гидрокарбонатом натрия 2% -15 мин. |
3. Хлорамин 1% - 30 мин. |
3. Хлорамин 5% - 240 мин. |
3.Хлорамин 3% - 60 мин. |
4.Перекись водорода 3% - (с 0,5% моющего средства)-80 мин. |
4. Перекись водорода 4% (с 0,5% моющего средства) - 180 мин. |
4.Перекись водорода 4% (с 0,5% моющего средства) - 90 мин. |
5.Паровой метод. Водяной насыщенный пар 0,5 кгс (кв см)-1100 С-20мин. |
|
5.Перекись водорода 6%- 60 мин. |
Таблица 2. Методы стерилизации и применяемая для этого аппаратура
Метод |
Прибор |
Режим |
Объекты |
Прокаливание (простой, полный) |
Газовая или спиртовая горелка |
Не менее 200о С, секунды или минуты |
Бактериологические петли, иглы, предметные стекла, инструменты |
Кипячение (простой, неполный) |
Стерилизатор |
100о С, минуты, часы |
Инструменты. Промежуточный этап обработки зараженных пипеток, шпателей, стекол |
Стерилизация паром под давлением (полный, сложный) |
Автоклав
|
1. Режим:- 2,0 атм-1320 С - 20 минут 2. Режим:- 0,7 атм. 1100 С, 45 минут |
Питательные среды (МПА, МПБ, ПВ). Зараженный материал в посуде, баках, трупы животных Питательные среды с углеводами и молоком, разлитые в стерильную посуду |
Стерилизация паром, дробная (полный, сложный) |
Автоклав с незакрытой крышкой |
100о С, 3 дня по 30 минут |
Желатин, иногда среды с углеводами или молоком |
Тиндализация (полный, простой) |
Водяная баня, кастрюля, бак |
56о С, 5-6 дней по 1 часу |
Сыворотки |
Стерилизация сухим жаром (полный, сложный) |
Сухожаровой шкаф (печь Пастера) |
1800 С, 60 минут |
Лабораторная посуда (пипетки, пробирки, колбы, чашки, шпатели) без сред и резиновых пробок |
Пастеризация (в бактериологической практике не применяется |
Специальные установки, кастрюля, бак |
60о С- 70о С, 20-30 минут |
Пищевая промышленность (молоко, пиво, вино и т.д.), детское молочное питание на молочных кухнях |
Фильтрование (сложный, полный, если нет вируса) |
Бактериальные фильтры, свечи из фарфора, каолина, асбестовые пластины, нитроцеллюлозные мембраны, миллипоровые фильтры |
При создании вакуума в полости свечи или в приемнике на установке Зейтца, минуты, часы |
Лекарства, не переносящие высокой температуры. Выделение вирусов. |
Ультрафиолетовые лучи (полный, сложный) |
Бактерицидные лампы |
Минуты и часы |
Боксы, помещения вирусологических и иммунологических лабораторий, операционные, перевязочные, процедурные |
Ультразвук |
Специальный ультразвуковой генератор |
Минуты, часы |
Пищевая промышленность, получение препаратов из бактерий, стерилизация воды |
Радиация |
Специальные установки |
Минуты, часы |
Предметы медицинского назначения |
31. Распространение микробов в окружающей среде. Микрофлора почвы, воды, воздуха, бытовых и медицинских объектов.
Микробы широко распространены в природе, используя для своего питания различные органические и даже минеральные вещества. Важными факторами, обеспечивающими широкое распространение микроорганизмов во внешней среде, являются их высокая скорость размножения, значительная устойчивость к неблагоприятным факторам внешней среды и высокая приспособляемость к меняющимся условиям обитания. Почва, вода и воздух могут служить источником микробного загрязнения продуктов питания, лекарственного сырья и препаратов, производственных помещений аптек, а также источником заражения людей патогенными микроорганизмами. Как правило, представители нормальной микрофлоры почвы, воды и воздуха не являются патогенными для человека. Основными путями попадания патогенных микроорганизмов от больных людей и носителей микробов в окружающую среду являются фекальный и воздушно-капельный.
Точное количественное определение бактерий (в том числе болезнетворных) в воде и других объектах внешней среды (почва, пищевые продукты, лекарственные препараты и др.) представляет значительные трудности в связи с невозможностью создания оптимальных условия для размножения всех встречающихся в исследуемом материале микроорганизмов, а также из-за различий их биологических свойств, низкой концентрацией, временным пребыванием и трудоемкостью исследований. Поэтому о загрязненности внешней среды выделениями человека судят по обнаружению в ней санитарно-показательных микроорганизмов. Эти микробы являются постоянными представителями нормальной микрофлоры организма человека и теплокровных животных, не находятся в других природных резервуарах или не имеют других естественных мест обитания. Санитарно-показательные микроорганизмы сохраняются жизнеспособными в окружающей среде в течение времени, сравнимого со сроками выживания отдельных видов патогенных бактерий, выделяющихся из организма теми же путями, они не способны интенсивно размножаться в окружающей среде и их количество остается постоянным определенный период времени после попадания в окружающую среду. Виды санитарно-показательных микроорганизмы, их количество и биологические свойства доступны для определения с помощью классических микробиологических методов.
Санитарно-показательными микроорганизмами для воды являются Е. coli, S. faecalis; для почвы - Е. coli, S. faecalis, С. perfringens; для воздуха - S. haemolyticus, S. viridans, S. aureus; для предметов обихода - E. coli, S. faecalis, S. аureus. Показателями фекального загрязнения среды служат E.coli, S.faecalis, C.perfringens; показателями орально-капельного загрязнения— S. viridans, S. haemolyticus и S. aureus. Сроки выживания в объектах окружающей среды Е. coli совпадают со сроками выживания патогенных кишечных бактерий. С. perfringens присутствуют в окружающей среде наиболее длительно. Присутствие S. faecalis является показателем свежей фекальной загрязненности. Если С. регfringens обнаруживается без Е. coli, то это свидетельствует о старом фекальном загрязнении среды.
Количественные характеристики микробной загрязненности почвы, воды и других объектов оцениваются по данным определения коли- и перфрингенс-индекса - количества клеток кишечной палочки или С. perfringens в 1 л воды или 1 г почвы.
Микрофлора почвы. Почва, содержащая различные органические соединения, является благоприятной средой для существования многих видов микроорганизмов и главным резервуаром микробов в природе. Из почвы микробы попадают в воду, воздух, на поверхность растений, других объектов внешней среды.
В почве содержатся многочисленные виды непатогенных бактерий, актиномицетов, грибов и простейших, а также некоторые болезнетворные микробы (например, палочка газовой гангрены, столбняка, сибирской язвы и др.).
Санитарно-бактериологический анализ почвы включает определение микробного числа и содержания санитарно-показательных микроорганизмов почвы.
Микробное число почвы — это общее количество микроорганизмов, содержащихся в 1 г почвы. Для его определения, пробы почвы, взятые в асептических условиях, измельчают, растирают и готовят десятикратные разведения (от 1:100 до 1:100 000). Посев выполняют либо в глубину питательного агара (1 мл соответствующего разведения вносят в стерильную чашку Петри и заливают 10 мл расплавленного и охлажденного до 450С МПА или сусло-агара), либо на поверхность питательного агара (0,1 мл соответствующего разведения суспензии распределяют шпателем по поверхности МПА или сусло-агара в чашке Петри). Чашки с сусло-агаром помещают в термостат при 240С (для выявления грибов), чашки с МПА при 370С (для выявления бактерий), инкубируют 48 ч, после чего подсчитывают количество выросших колоний для каждого разведения почвы, вычисляя затем средний показатель микробного числа почвы.
Для определения коли-индекса почвы используют элективные питательные среды, например, жидкую среду Кесслера, содержащую пептон и лактозу (сбраживается кишечной палочкой с образованием кислоты и газа), а также желчь и краситель генциановый фиолетовый, которые подавляют рост многих почвенных микроорганизмов, но не препятствуют росту кишечной палочки. Для улавливания газа, образовавшегося в результате расщепления лактозы, служат специальные стеклянные «поплавки». После суточной инкубации посевов почвы на среде Кесслера отбирают положительные пробы, характеризующие рост Е.coli в виде диффузного роста и образования газа, скапливающегося в «поплавке». Из этих проб делают высевы на среду Эндо, инкубируют их при 370С 24 ч, отмечая характерные для Е. coli темно-красные колонии с металлическим блеском, из которых готовят мазки и при наличии в них грамотрицательных палочек делают вывод о присутствии Е. coli.
Перфрингенс-титр почвы – наименьшее ее количество в граммах, в котором содержится одна жизнеспособная клетка Cl. perfringens, определяется на железо-сульфитном агаре (среда Вильсона — Блера). Посев почвы производят из дестикратных разведений почвенной суспензии, прогретых при 800 С 10—15 мин с целью инактивации вегетативных форм бактерий. Затем из соответствующих разведений берут стерильной пипеткой по 1 мл суспензии и вносят в пробирку с расплавленной средой Вильсона-Блера. Посев помещают в термостат при 37-430 С. При наличии в пробе Cl. perfringens через 3-18 часов образуется сульфид железа (FeS), окрашивающий колонии этого микроорганизма в черный цвет. При ферментации глюкозы образуются газы, разрывающие среду. Можно использовать также молочные среды, на которых Cl. perfringens энергично сбраживает лактозу, в результате этого молоко быстро (в течение 3—4 ч) створаживается в виде губчатого сгустка, а образующийся при этом газ разрывает сгустки казеина, вытесняя их в верхнюю часть пробирки. Наличие Cl. perfringens в средах подтверждается микроскопическим методом (в мазках, окрашенных по Граму, обнаруживают крупные грамположительные палочки с центрально расположенной спорой, которые могут располагаться цепочками).
Микрофлора воды. Вода открытых водоемов содержит различное количество микроорганизмов в зависимости от содержания в ней органических веществ, глубины залегания водоносного слоя и характера грунта. Загрязнение воды открытых водоемов происходит сточными водами и с поверхности почвы, содержащими большое количество различных микробов, включая кишечную палочку. В воду могут попадать болезнетворные микробы, в частности, возбудители кишечных инфекций (брюшного тифа и паратифов, дизентерии, холеры и др.).
Санитарно-бактериологический анализ воды проводится с целью определения микробного числа (общего количества мезофильных аэробных и факультативных анаэробных микроорганизмов) в 1 мл воды и содержания санитарно-показательных микроорганизмов.
Для определения микробного числа 1 мл воды вносят в 2 пустые стерильные чашки Петри, в которые наливают 10-12 мл расплавленного при температуре 450С МПА в одну чашку и такое же количество сусло-агара во вторую, перемешивают и после застывания сред культивируют на МПА при 370С 24 ч, а на сусло-агаре для выявления роста грибов 2—3 сут при температуре 240С. Учитывают число колоний микроорганизмов, что соответствует микробному числу воды, которое для питьевой воды централизованного водоснабжения не должно превышать 50 микробных клеток в 1 мл.
В аптеках этим методом определяют микробное число дистиллированной воды, которое должно равняться 10-15. Пробы дистиллированной воды, используемой для приготовления лекарственных средств (кроме лекарств для инъекций и глазных капель), в объеме 300 мл отбирают из бюретки, конец которой обжигают ватой, смоченной спиртом, помещают в стерильные бутылки, закрываемых затем ватными пробками и бумажными колпачками. Пробы дистиллированной воды, используемой для приготовления инъекционных растворов и глазных капель, отбирают в стерильные флаконы в количестве 15—20 см3 (мл) из емкостей, в которых проводится стерилизация.
Определение кишечных палочек в воде (коли-индекс) проводят с использованием 2 методов - двухэтапного бродильного и метода мембранных фильтров.
Анализ воды с помощью двухэтапного бродильного метода проводят в трех параллельных рядах, начиная с 10; 1 и 0,1 мл. Для объемов 10 мл используют флаконы по 100 мл лактозо-пептонной среды, все остальные объемы воды вносят в пробирки с 5 мл питательной среды. Водопроводная вода исследуется в трех объемах по 100 мл воды, трех - по 10 мл воды и трех - по 1 мл. Культивирование посевов производят при 380С в течение 24 ч. В случае отсутствия помутнения среды и образования газа через сутки дается отрицательный ответ. При наличии помутнения среды кислоты и газа из такого флакона производят посев на сектора чашки со средой Эндо. Если через 16-18 ч на среде вырастают темно-красные с металлическим блеском или колонии без блеска, из них готовят мазки и проводят пробу на оксидазу (снимают по 2-3 колонии и наносят на фильтровальную бумагу, смоченную диметил-пара-фенилендиамином; кишечная палочка оксидазой не обладает, поэтому изменения цвета фильтровальной бумаги не происходит). Наличие в мазках грамотрицательных палочек и отсутствие оксидазы свидетельствует о положительном результате исследований, которые выражают в виде коли-индекса (количество кишечных палочек в 1 л воды). Для питьевой воды централизованного водоснабжения коли-индекс не должен быть больше трех.
Для определения коли-индекса воды методом мембранных фильтров фильтруют воду в объеме от 300 до 500 мл, помещая затем фильтр на поверхность среды Эндо. Чашки с фильтрами инкубируют при 370С в течение 18-24 ч. Количество темно-красных колоний с металлическим блеском на фильтре, в которых при микроскопическом исследовании находят грамотрицательные палочки, соответствует коли-индексу при перерасчете показателя на 1 литр воды. Для водопроводной воды коли-индекс составляет 2.
Другим санитарно-показательным микроорганизмом, свидетельствующем о фекальном загрязнении воды, является энтерококк (Streptococcus faecalis). Индекс энтерококков в исследуемой воде определяют в параллельных рядах посевов в жидкой щелочно-полимиксиновой среде с 10-кратными разведениями в зависимости от предполагаемого бактериального загрязнения воды от 100 до 0,01 мл. Объемы воды по 100 и 10 мл вносят в щелочно-полимиксиновую среду двойной концентрации, остальные объемы — в пробирки со средой обычной концентрации, учет производят после 24 ч инкубации при 37 °С по изменению цвета и помутнению среды. Из этих флаконов проводят высев на сектора чашки с молочно-ингибиторной средой. Фекальный стрептококк растет на секторах чашек в виде черных колоний с металлическим блеском.
Микрофлора воздуха. Воздух не является благоприятной средой для обитания микробов, попадающих в него из почвы, воды, организма человека и животных, существуя в нем ограниченный промежуток времени. В воздухе найдены сапрофитные спорообразующие бактерии, стафилококки, сарцины, споры грибов, а также некоторые патогенные виды микробов, выделяемые человеком через верхние дыхательные пути при воздушно-капельных инфекциях (грипп, респираторные инфекции, коклюш, дифтерия и др.).
Санитарно-бактериологическое исследование воздуха. Включает определение микробного числа воздуха и санитарно-показательных микроорганизмов.
Микробное число воздуха определяется обычно аспирационным методом с помощью аппарата Кротова (рис.33, см. приложение) со скоростью просасывания воздуха не менее 25 л/мин. В аппарате Кротова воздух засасывается через щель, ударяясь о поверхность питательной среды в чашке Петри. В качестве питательной среды для определения микробного числа пользуются мясо-пептонным агаром, а для определения санитарно-показательных микроорганизмов применяются специальные питательные среды (для выявления золотистого стафилококка - молочно-солевой или желточно-солевой агар и для обнаружения стрептококков - среда Гарро). Преимуществом этого метода является возможность посева определенного объема воздуха. Для определения общего числа бактерий количество пропущенного воздуха составляет 100 л, для выявления санитарно-показательных микроорганизмов (золотистого стафилококка), дрожжевых и плесневых грибов - 250 л. Для определения роста сапрофитных бактерий используют МПА, грибов - сусло-агар и агар Сабуро, золотистого стафилококка — желточно-солевой агар. В каждом помещении аптеки посев делают на 5-10 чашек Петри с МПА и желточно-солевым агаром. Посевы помещают в термостат при 370С на 24 ч, после чего выдерживают 24 ч при комнатной температуре; посевы на среде Сабуро выращивают при 22—280С 4 сут. Затем подсчитывают количество выросших колоний и производят пересчет на 1 м3 воздуха. Идентификацию золотистого стафилококка, выросшего на желточно-солевом агаре проводят по общепринятым тестам. Допустимые нормы микробного числа воздуха различных помещений аптеки представлены в табл. 6.
В последнее время для определения микрофлоры воздуха разработаны более совершенные приборы – импакторы (рис. 34, см. приложение).
В качестве ориентировочного метода оценки микрофлоры воздуха может использоваться седиментационный метод.
Для этого чашки Петри с плотной питательной средой открывают в местах отбора проб воздуха, выдерживая в течение 5-30 мин, после чего чашки закрывают и помещают их в термостат. По количеству выросших колоний подсчитывают микробное число воздуха, пользуясь правилом Омелянского, в соответствии с которым считают, что на поверхность питательной среды площадью 100 см2 в течение 5 мин оседает столько микроорганизмов, сколько их содержится в 10 л воздуха. Каждая микробная клетка дает начало одной колонии. Зная количество выросших колоний и время экспозиции, вычисляют количество микробов, содержащихся в 1 м3 (1000 л) воздуха.
Результаты определения микробной загрязненности воздуха различных помещений аптек представлены в таблице 6.
Согласно действующим санитарным правилам, микробиологическое исследование воздуха различных помещений аптек осуществляется работниками центров санитарно-эпидемиологического надзора не реже одного раза в квартал.
Анализ микробной загрязненности столов, оборудования, аптечной посуды, полотенец, халатов, рук персонала. Санитарно-бактериологическому анализу подвергаются смывы со столов, оборудования, полотенец, халатов и рук работников аптек (1 раз в месяц); растворы для инъекций, глазные капли до стерилизации, нестерильные лекарственные формы; аптечная посуда и пробки на общую микробную обсемененность (2 раза в квартал). Эти исследования направлены на проверку качества мытья посуды, соблюдения правил санитарного режима и приготовления лекарственных препаратов. Кроме определения микробного числа, исследуют состав микрофлоры на наличие Е. coli, энтерококков, энтеровирусов, S. aureus, синегнойной палочки и бактерий рода Proteus, а при необходимости - патогенных микроорганизмов.
32. Микрофлора организма человека и ее функции. Симбиоз и антибиоз. Возрастные особенности микрофлоры человека.
Микрофлора тела человека. На поверхности тела человека (коже и слизистых оболочках), а также в открытых системах (дыхательной, пищеварительной, мочеполовой) находится большое количество различных микроорганизмов, составляющих нормальную микрофлору. Заселение организма ребенка микроорганизмами внешней среды начинает происходить сразу же после рождения, приобретая в конечном итоге черты некоторой специфичности по качественному составу и количеству различных видов микроорганизмов в определенных биотопах организма.
Так, на поверхности кожи и слизистых оболочек человека находят кокки (стафилококки, микрококки, стрептококки), грибы (дрожжи, плесневые грибы), некоторые грамположительные и грамотрицательные палочки. Часть перечисленных микробов принадлежит к группе условно-патогенных микроорганизмов и при нарушениях функций иммунной системы способны вызвать различные заболевании, например, пиодермии.
Микрофлора полости рта многочисленна и богата по видовому составу. Это связано с благоприятными условиями для развития микроорганизмов (оптимальные температура, влажность, рН, обилие питательных веществ). В полости рта и зубном налете найдены различные стрептококки, грамположительные и грамотрицательные бактерии, непатогенные вибрионы, спириллы, спирохеты, актиномицеты, дрожжеподобные грибы, псевдодифтерийные палочки (дифтероиды), простейшие (Entamoeba buccalis) и т. д. В ткани миндалин обнаружены микоплазмы и аденовирусы. Микроорганизмы полости рта способны вызывать заболевания десен и зубов (кариес, стоматиты и т. д.).
Микрофлора слизистых оболочек глаза скудна (постоянные обитатели конъюнктивы сапрофитические стафилококки и Corynebacterium xerosis), поскольку слезная жидкость содержит лизоцим, губительно действующий на микроорганизмы.
На слизистых оболочках носа обитают стрептококки, стафилококки, дифтероиды. В верхних дыхательных путях обнаружено много микроорганизмов, попадающих туда при дыхании, в то время как бронхиолы и альвеолы практически лишены микроорганизмов.
В желудке содержание микроорганизмов минимально вследствие кислой реакции среды и высокой активности протеолитических ферментов. Снижение кислотности желудочного сока приводит к развитию в желудке обильной микрофлоры, в которой преобладают сарцины, дрожжи, некоторые спорообразующие - палочки. В тонком кишечнике более благоприятные условия для микроорганизмов в связи со щелочной реакции среды, однако качественный состав микрофлоры беден, а количество микроорганизмов невелико вследствие бактерицидности секрета тонкого кишечника. Наибольшее количество микробов различных видов (кишечная палочка, молочнокислые бактерии, анаэробы – бактериоиды, бифидобактерии и пр.) содержит толстый кишечник, в котором обнаружено до 260 видов микроорганизмов. Подавляющее большинство микрофлоры кишечника представлено анаэробами (бактероиды, бифидобактерии, клостридии - Cl. perfringens, Cl. sporogenes). Типичными постоянным обитателями толстого кишечника являются кишечная палочка, стафилококки, стрептококки (S. faecalis), бактерии рода Citrobacter, дрожжи, кишечные вирусы, простейшие (кишечная амеба) и другие микроорганизмы. На слизистой оболочке женских половых органов обитают молочнокислые бактерии (палочки Додерлейна), кокки, немногочисленные анаэробы, микоплазмы, часто встречаются грибы рода Candida.
Содержание микрофлоры кишечника в колониеобразующих единицах (КОЕ) у здорового человека представлено в таблице 4.
Для изучения нормальной микрофлоры человеческого организма используют микроскопический и бактериологический методы.
У здорового человека микрофлора находится в состоянии динамического равновесия – эубиоза. Нарушения количественного и качественного состава нормальной микрофлоры с утратой ее функций под влиянием факторов внешней среды, стрессов, бесконтрольного применения антимикробных препаратов, лучевой и химиотерапии приводит к развитию дисбактериоза или дисбиоза. Для восстановления нормальной микрофлоры при дисбиозе назначаются эубиотики – препараты из живых бактерий, являющихся представителями нормальной микрофлоры (бифидобактерии, кишечная палочка, лактобактерии и т.д. – табл.5) и обладающих выраженными антагонистическими свойствами в отношении ряда патогенных кишечных бактерий, что позволяет применять их для лечения кишечных инфекций.
Микроорганизмы, обитающие во внешней среде, в организме человека или животных могут сожительствовать между собой (симбиоз). Формами симбиоза являются мутуализм (взаимовыгодный симбиоз), метабиоз (один микроорганизм использует для своих целей продукты жизнедеятельности другого микроорганизма), комменсализм (один микроорганизм извлекает для себя выгоду от другого, не причиняя ему вреда), сателлизм (усиление роста одного вида микроорганизма по влиянием другого).
Антагонистические взаимоотношения или антагоностический симбиоз выражается в виде неблагоприятных эффектов одних микроорганизмов на другие. Антагонизм проявляется в виде подавления роста бактерий (бактериостатические эффекты) или растворения, гибели бактерий (бактериолитические, бактерицидные эффекты), что может быть связано с прямым влиянием микробов друг на друга или неспецифическим действием антимикробных продуктов обмена бактерий (кислоты, щелочи, спирты, перекиси, сероводород, аммиак, антибиотики, бактериоцины и др.). Явление антагонизма широко применяется в практических целях для поиска и создания антибиотиков.
33. Определение понятий дисбиоз, дисбактериоз, оппортунистическая инфекция. Пробиотики (эубиотики), их применение в педиатрии.
У здорового человека микрофлора находится в состоянии динамического равновесия – эубиоза. Нарушения количественного и качественного состава нормальной микрофлоры с утратой ее функций под влиянием факторов внешней среды, стрессов, бесконтрольного применения антимикробных препаратов, лучевой и химиотерапии приводит к развитию дисбактериоза или дисбиоза. Для восстановления нормальной микрофлоры при дисбиозе назначаются эубиотики – препараты из живых бактерий, являющихся представителями нормальной микрофлоры (бифидобактерии, кишечная палочка, лактобактерии и т.д. – табл.5) и обладающих выраженными антагонистическими свойствами в отношении ряда патогенных кишечных бактерий, что позволяет применять их для лечения кишечных инфекций.
Состояние эубиоза — динамического равновесия нормальной микрофлоры и организма человека — может нарушаться под влиянием факторов окружающей среды, стрессовых воздействий, широкого и бесконтрольного применения антимикробных препаратов, лучевой терапии и химиотерапии, нерационального питания, оперативных вмешательств и т. д. В результате нарушается колонизационная резистентность. Аномально размножившиеся транзиторные микроорганизмы продуцируют токсичные продукты метаболизма — индол, скатол, аммиак, сероводород.
Состояния, развивающиеся в результате утраты нормальных функций микрофлоры, называются дисбактериозом и дисбиозом.
При дисбактериозе происходят стойкие количественные и качественные изменения бактерий, входящих в состав нормальной микрофлоры. При дисбиозе изменения происходят и среди других групп микроорганизмов (вирусов, грибов и др.). Дисбиоз и дисбактериоз могут приводить к эндогенным инфекциями.
Дисбиозы классифицируют по этиологии (грибковый, стафилококковый, протейный и др.) и по локализации (дисбиоз рта, кишки, влагалища и т. д.). Изменения в составе и функциях нормальной микрофлоры сопровождаются различными нарушениями: развитием инфекций, диарей, запоров, синдрома мальабсорбции, гастритов, колитов, язвенной болезни, злокачественных новообразований, аллергий, мочекаменной болезни, гипо- и гиперхолестеринемии, гипо- и гипертензии, кариеса, артрита, поражений печени и др.
Нарушения нормальной микрофлоры человека определяются следующим образом:
1. Выявление видового и количественного состава представителей микробиоценоза определенного биотопа (кишки, рта, влагалища, кожи и т. д.) — путем высева из разведений исследуемого материала или путем отпечатков, смыва на соответствующие питательные среды (среда Блаурокка — для бифидобактерий; среда МРС-2 — для лактобактерий; анаэробный кровяной агар — для бактероидов; среда Левина или Эндо — для энтеробактерий; желчно-кровяной агар — для энтерококков; кровяной агар — для стрептококков и гемофилов; мясопептонный агар с фурагином — для синегнойной палочки, среда Сабуро — для грибов и др.).
2. Определение в исследуемом материале микробных метаболитов — маркеров дисбио-за (жирных кислот, гидроксижирных кислот, жирнокислотных альдегидов, ферментов и др.). Например, обнаружение в фекалиях бета-аспартил-глицина и бета-аспартиллизина свидетельствует о нарушении кишечного микробиоценоза, так как в норме эти дипеп-тиды метаболизируются кишечной анаэробной микрофлорой.
Для восстановления нормальной микрофлоры: а) проводят селективную деконтами-нацию; б) назначают препараты пробиотиков (эубиотиков), полученные из лиофильно высушенных живых бактерий — представителей нормальной микрофлоры кишечника — бифидобактерий (бифидумбактерин), кишечной палочки (колибактерин), лактобактерий (лактобактерин) и др.
Пробиотики — препараты, оказывающие при приеме per os нормализирующее действие на организм человека и его микрофлору.
34. Понятие о химиотерапии и химиотерапевтических препаратах.
Химиотерапия — специфическое антимикробное, антипаразитарное лечение при помощи химических веществ. Эти вещества обладают важнейшим свойством — избирательностью действия против болезнетворных микроорганизмов в условиях макроорганизма.
Основоположником химиотерапии является немецкий химик, лауреат Нобелевской премии П.Эрлих, который установил, что химические вещества, содержащие мышьяк, губительно действуют на спирохеты и трипаносомы, и получил в 1910 г. первый химиотерапевтический препарат — сальварсан (соединение мышьяка, убивающее возбудителя, но безвредное для микроорганизма).
В 1935 г. другой немецкий химик Г.Домагк обнаружил среди анилиновых красителей вещество — пронтозил, или красный стрептоцид, спасавший экспериментальных животных от стрептококковой инфекции, но не действующий на эти бактерии вне организма. За это открытие Г.Домагк был удостоен Нобелевской премии. Позднее было выяснено, что в организме происходит распад пронтозила с образованием сульфаниламида, обладающего антибактериальной активностью как in vivo, так и in vitro.
Механизм действия сульфаниламидов (сульфонамидов) на микроорганизмы был открыт Р.Вудсом, установившим, что сульфаниламиды являются структурными аналогами парааминобензойной кислоты (ПАБК), участвующей в биосинтезе фолиевой кислоты, необходимой для жизнедеятельности бактерий. Бактерии, используя сульфаниламид вместо ПАБК, погибают.
Первый природный антибиотик был открыт в 1929 г. английским бактериологом А.Флемингом. При изучении плесневого гриба Penicillium notatum, препятствующего росту бактериальной культуры, А. Флеминг обнаружил вещество, задерживающее рост бактерий, и назвал его пенициллином. В 1940 г. Г. Флори и Э. Чейн получили очищенный пенициллин. В 1945 г. А Флеминг, Г. Флори и Э. Чейн стали Нобелевскими лауреатами.
В настоящее время имеется огромное количество химиотерапевтических препаратов, которые применяются для лечения заболеваний, вызванных различными микроорганизмами.
35. Антибиотики. Классификация. Антибактериальная химиотерапия. Мишени для антибиотиков в прокариотической клетке.
Антибиотики — химиотерапевтические вещества, продуцируемые микроорганизмами, животными клетками, растениями, а также их производные и синтетические продукты, которые обладают избирательной способностью угнетать и задерживать рост микроорганизмов, а также подавлять развитие злокачественных новообразований.
За тот период, который прошел со времени открытия П.Эрлиха, было получено более 10 000 различных антибиотиков, поэтому важной проблемой являлась систематизация этих препаратов. В настоящее время существуют различные классификации антибиотиков, однако ни одна из них не является общепринятой.
В основу главной классификации антибиотиков положено их химическое строение.
Наиболее важными классами синтетических антибиотиков являются хинолоны и фторхинолоны (например, ципрофлоксацин), сульфаниламиды (сульфадиметоксин), имидазолы (метронидазол), нитрофураны (фурадонин, фурагин).
По спектру действия антибиотики делят на пять групп в зависимости от того, на какие микроорганизмы они оказывают воздействие. Кроме того, существуют противоопухолевые антибиотики, продуцентами которых также являются актиномицеты. Каждая из этих групп включает две подгруппы: антибиотики широкого и узкого спектра действия.
Антибактериальные антибиотики составляют самую многочисленную группу препаратов. Преобладают в ней антибиотики широкого спектра действия, оказывающие влияние на представителей всех трех отделов бактерий. К антибиотикам широкого спектра действия относятся аминогликозиды, тетрациклины и др. Антибиотики узкого спектра действия эффективны в отношении небольшого круга бактерий, например полет-миксины действуют на грациликутные, ванкомицин влияет на грамположительные бактерии.
В отдельные группы выделяют противотуберкулезные, противолепрозные, противосифилитические препараты.
Противогрибковые антибиотики включают значительно меньшее число препаратов. Широким спектром действия обладает, например, амфотерицин В, эффективный при кандидозах, бластомикозах, аспергиллезах; в то же время нистатин, действующий на грибы рода Candida, является антибиотиком узкого спектра действия.
Антипротозойные и антивирусные антибиотики насчитывают небольшое число препаратов.
Противоопухолевые антибиотики представлены препаратами, обладающими цитотоксическим действием. Большинство из них применяют при многих видах опухолей, например митоми-цин С.
Действие антибиотиков на микроорганизмы связано с их способностью подавлять те или иные биохимические реакции, происходящие в микробной клетке.
В зависимости от механизма действия различают пять групп антибиотиков:
1. антибиотики, нарушающие синтез клеточной стенки. К этой группе относятся, например, β-лактамы. Препараты этой группы характеризуются самой высокой избирательностью действия: они убивают бактерии и не оказывают влияния на клетки микроорганизма, так как последние не имеют главного компонента клеточной стенки бактерий — пептидогликана. В связи с этим β -лактамные антибиотики являются наименее токсичными для макроорганизма;
2. антибиотики, нарушающие молекулярную организацию и синтез клеточных мембран. Примерами подобных препаратов являются полимиксины, полиены;
3. антибиотики, нарушающие синтез белка; это наиболее многочисленная группа препаратов. Представителями этой группы являются аминогликозиды, тетрациклины, макроли-ды, левомицетин, вызывающие нарушение синтеза белка на разных уровнях;
4. антибиотики — ингибиторы синтеза нуклеиновых кислот. Например, хинолоны нарушают синтез ДНК, рифампицин — синтез РНК;
5. антибиотики, подавляющие синтез пуринов и аминокислот. К этой группе относятся, например, сульфаниламиды.
Источники антибиотиков.
Основными продуцентами природных антибиотиков являются микроорганизмы, которые, находясь в своей естественной среде (в основном, в почве), синтезируют антибиотики в качестве средства выживания в борьбе за существование. Животные и растительные клетки также могут вырабатывать некоторые вещества с селективным антимикробным действием (например, фитонциды), однако широкого применения в медицине в качестве продуцентов антибиотиков они не получили.
Таким образом, основными источниками получения природных и полусинтетических антибиотиков стали:
• Актиномицеты (особенно стрептомицеты) — ветвящиеся бактерии. Они синтезируют большинство природных антибиотиков (80 %).
• Плесневые грибы — синтезируют природные бета-лактамы (грибы рода Cephalosporium и Penicillium)H фузидиевую кислоту.
• Типичные бактерии — например, эубактерии, бациллы, псевдомонады — продуцируют бацитрацин, полимиксины и другие вещества, обладающие антибактериальным действием.
Способы получения.
Существует три основных способа получения антибиотиков:
• биологический синтез (так получают природные антибиотики — натуральные продукты ферментации, когда в оптимальных условиях культивируют микробы-продуценты, которые выделяют антибиотики в процессе своей жизнедеятельности);
• биосинтез с последующими химическими модификациями (так создают полусинтетические антибиотики). Сначала путем биосинтеза получают природный антибиотик, а затем его первоначальную молекулу видоизменяют путем химических модификаций, например присоединяют определенные радикалы, в результате чего улучшаются противомикробные и фармакологические характеристики препарата;
• химический синтез (так получают синтетические аналоги природных антибиотиков, например хлорамфеникол/левомицетин). Это вещества, которые имеют такую же структуру,
36. Механизмы лекарственной устойчивости возбудителей инфекционных болезней и пути ее преодоления.
Антибиотикорезистентность — это устойчивость микробов к антимикробным химиопрепаратам. Бактерии следует считать резистентными, если они не обезвреживаются такими концентрациями препарата, которые реально создаются в макроорганизме. Резистентность может быть природной и приобретенной.
Природная устойчивость. Некоторые виды микробов природно устойчивы к определенным семействам антибиотиков или в результате отсутствия соответствующей мишени (например, микоплазмы не имеют клеточной стенки, поэтому не чувствительны ко всем препаратам, действующим на этом уровне), или в результате бактериальной непроницаемости для данного препарата (например, грамотрицательные микробы менее проницаемы для крупномолекулярных соединений, чем грамположительные бактерии, так как их наружная мембрана имеет «маленькие» поры).
Приобретенная устойчивость. Приобретение резистентности — это биологическая закономерность, связанная с адаптацией микроорганизмов к условиям внешней среды. Она, хотя и в разной степени, справедлива для всех бактерий и всех антибиотиков. К химиопрепаратам адаптируются не только бактерии, но и остальные микробы — от эукариотических форм (простейшие, грибы) до вирусов. Проблема формирования и распространения лекарственной резистентности микробов особенно значима для внутрибольничных инфекций, вызываемых так называемыми «госпитальными штаммами», у которых, как правило, наблюдается множественная устойчивость к антибиотикам (так называемая полирезистентность).
Генетические основы приобретенной резистентности. Устойчивость к антибиотикам определяется и поддерживается генами резистентности (r-генами) и условиями, способствующими их распространению в микробных популяциях. Приобретенная лекарственная устойчивость может возникать и распространяться в популяции бактерий в результате:
• мутаций в хромосоме бактериальной клетки с последующей селекцией (т. е. отбором) мутантов. Особенно легко селекция происходит в присутствии антибиотиков, так как в этих условиях мутанты получают преимущество перед остальными клетками популяции, которые чувствительны к препарату. Мутации возникают независимо от применения антибиотика, т. е. сам препарат не влияет на частоту мутаций и не является их причиной, но служит фактором отбора. Далее резистентные клетки дают потомство и могут передаваться в организм следующего хозяина (человека или животного), формируя и распространяя резистентные штаммы. Мутации могут быть: 1) единичные (если мутация произошла в одной клетке, в результате чего в ней синтезируются измененные белки) и 2) множественные (серия мутаций, в результате чего изменяется не один, а целый набор белков, например пени-циллинсвязывающих белков у пенициллин-резистентного пневмококка);
• переноса трансмиссивных плазмид резистентности (R-плазмид). Плазмиды резистентности (трансмиссивные) обычно кодируют перекрестную устойчивость к нескольким семействам антибиотиков. Впервые такая множественная резистентность была описана японскими исследователями в отношении кишечных бактерий. Сейчас показано, что она встречается и у других групп бактерий. Некоторые плазмиды могут передаваться между бактериями разных видов, поэтому один и тот же ген резистентности можно встретить у бактерий, таксономически далеких друг от друга. Например, бета-лактамаза, кодируемая плазмидой ТЕМ-1, широко распространена у грамотрицательных бактерий и встречается у кишечной палочки и других кишечных бактерий, а также у гонококка, резистентного к пенициллину, и гемофильной палочки, резистентной к ампициллину;
• переноса транспозонов, несущих r-гены (или мигрирующих генетических последовательностей). Транспозоны могут мигрировать с хромосомы на плазмиду и обратно, а также с плазмиды на другую плазмиду. Таким образом гены резистентности могут передаваться далее дочерним клеткам или при рекомбинации другим бактериям-реципиентам.
Реализация приобретенной устойчивости. Изменения в геноме бактерий приводят к тому, что меняются и некоторые свойства бактериальной клетки, в результате чего она становится устойчивой к антибактериальным препаратам. Обычно антимикробный эффект препарата осуществляется таким образом: агент должен связаться с бактерией и пройти сквозь ее оболочку, затем он должен быть доставлен к месту действия, после чего препарат взаимодействует с внутриклеточными мишенями. Реализация приобретенной лекарственной устойчивости возможна на каждом из следующих этапов:
• модификация мишени. Фермент-мишень может быть так изменен, что его функции не нарушаются, но способность связываться с химиопрепаратом (аффинность) резко снижается или может быть включен «обходной путь» метаболизма, т. е. в клетке активируется другой фермент, который не подвержен действию данного препарата.
• «недоступность» мишени за счет снижения проницаемости клеточной стенки и клеточных мембран или «эффлюко-механизма, когда клетка как бы «выталкивает» из себя антибиотик.
• инактивация препарата бактериальными ферментами. Некоторые бактерии способны продуцировать особые ферменты, которые делают препараты неактивными (например, бета-лактамазы, аминогликозид-модифицирующие ферменты, хлорамфениколацетилтрансфераза). Бета-лактамазы — это ферменты, разрушающие бета-лактамное кольцо с образованием неактивных соединений. Гены, кодирующие эти ферменты, широко распространены среди бактерий и могут быть как в составе хромосомы, так и в составе плазмиды.
Для борьбы с инактивирующим действием бета-лактамаз используют вещества — ингибиторы (например, клавулановую кислоту, сульбактам, тазобактам). Эти вещества содержат в своем составе бета-лактамное кольцо и способны связываться с бета-лактамазами, предотвращая их разрушительное действие на бета-лактамы. При этом собственная антибактериальная активность таких ингибиторов низкая. Клавулановая кислота ингибирует большинство известныхбета-лактамаз. Ее комбинируют с пеницил-линами: амоксициллином, тикарциллином, пиперациллином.
Предупредить развитие антибиотикорезистентности у бактерий практически невозможно, но необходимо использовать антимикробные препараты таким образом, чтобы не способствовать развитию и распространению устойчивости (в частности, применять антибиотики строго по показаниям, избегать их использования с профилактической целью, через 10—15 дней ан-тибиотикотерапии менять препарат, по возможности использовать препараты узкого спектра действия, ограниченно применять антибиотики в ветеринарии и не использовать их как фактор роста).
37. Методы определения чувствительности бактерий к антибиотикам
Для определения чувствительности бактерий к антибиотикам (антибиотикограммы) обычно применяют:
• Метод диффузии в агар. На агаризованную питательную среду засевают исследуемый микроб, а затем вносят антибиотики. Обычно препараты вносят или в специальные лунки в агаре, или на поверхности посева раскладывают диски с антибиотиками («метод дисков»). Учет результатов проводят через сутки по наличию или отсутствию роста микробов вокруг лунок (дисков). Метод дисков — качественный и позволяет оценить, чувствителен или устойчив микроб к препарату.
• Методы определения минимальных ингибирующих и бактерицидных концентраций, т. е. минимального уровня антибиотика, который позволяет in vitro предотвратить видимый рост микробов в питательной среде или полностью ее стерилизует. Это количественные методы, которые позволяют рассчитать дозу препарата, так как концентрация антибиотика в крови должна быть значительно выше минимальной ингибирующей концентрации для возбудителя инфекции. Введение адекватных доз препарата необходимо для эффективного лечения и профилактики формирования устойчивых микробов.
Есть ускоренные способы, с применением автоматических анализаторов.
Определение чувствительности бактерий к антибиотикам методом дисков. Исследуемую бактериальную культуру засевают газоном на питательный агар или среду АГВ в чашке Петри.
Среда АГВ: сухой питательный рыбный бульон, агар-агар, натрий фосфат двузамещенный. Среду готовят из сухого порошка в соответствии с инструкцией.
На засеянную поверхность пинцетом помещают на одинаковом расстоянии друг от друга бумажные диски, содержащие определенные дозы разных антибиотиков. Посевы инкубируют при 37 °С до следующего дня. По диаметру зон задержки роста исследуемой культуры бактерий судят о ее чувствительности к антибиотикам.
Для получения достоверных результатов необходимо применять стандартные диски и питательные среды, для контроля которых используются эталонные штаммы соответствующих микроорганизмов. Метод дисков не дает надежных данных при определении чувствительности микроорганизмов к плохо диффундирующим в агар полипептидным антибиотикам (например, полимиксин, ристомицин). Если эти антибиотики предполагается использовать для лечения, рекомендуется определять чувствительность микроорганизмов методом серийных разведений.
Определение чувствительности бактерий к антибиотикам методом серийных разведений. Данным методом определяют минимальную концентрацию антибиотика, ингибирующую рост исследуемой культуры бактерий. Вначале готовят основной раствор, содержащий определенную концентрацию антибиотика (мкг/мл или ЕД/мл) в специальном растворителе или буферном растворе. Из него готовят все последующие разведения в бульоне (в объеме 1 мл), после чего к каждому разведению добавляют 0,1 мл исследуемой бактериальной суспензии, содержащей 106—107 бактериальных клеток в 1 мл. В последнюю пробирку вносят 1 мл бульона и 0,1 мл суспензии бактерий (контроль культуры). Посевы инкубируют при 37 °С до следующего дня, после чего отмечают результаты опыта по помутнению питательной среды, сравнивая с контролем культуры. Последняя пробирка с прозрачной питательной средой указывает на задержку роста исследуемой культуры бактерий под влиянием содержащейся в ней минимальной ингибирующей концентрации (МИК) антибиотика.
Оценку результатов определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам проводят по специальной готовой таблице, которая содержит пограничные значения диаметров зон задержки роста для устойчивых, умеренно устойчивых и чувствительных штаммов, а также значения МИК антибиотиков для устойчивых и чувствительных штаммов.
К чувствительным относятся штаммы микроорганизмов, рост которых подавляется при концентрациях препарата, обнаруживаемых в сыворотке крови больного при использовании обычных доз антибиотиков. К умеренно устойчивым относятся штаммы, для подавления роста которых требуются концентрации, создающиеся в сыворотке крови при введении максимальных доз препарата. Устойчивыми являются микроорганизмы, рост которых не подавляется препаратом в концентрациях, создаваемых в организме при использовании максимально допустимых доз.
Определение антибиотика в крови, моче и других жидкостях организма человека. В штатив устанавливают два ряда пробирок. В одном из них готовят разведения эталонного антибиотика, в другом — исследуемой жидкости. Затем в каждую пробирку вносят взвесь тест-бактерий, приготовленную в среде Гисса с глюкозой. При определении в исследуемой жидкости пенициллина, тетрациклинов, эритромицина в качестве тест-бактерий используют стандартный штамм S. aureus, а при определении стрептомицина — Е. coli. После инкубирования посевов при 37 °С в течение 18—20 ч отмечают результаты опыта по помутнению среды и ее окрашиванию индикатором вследствие расщепления глюкозы тест-бактериями. Концентрация антибиотика определяется умножением наибольшего разведения исследуемой жидкости, задерживающей рост тест-бактерий, на минимальную концентрацию эталонного антибиотика, задерживающего рост тех же тест-бактерий. Например, если максимальное разведение исследуемой жидкости, задерживающее рост тест-бактерий, равно 1 :1024, а минимальная концентрация эталонного антибиотика, задерживающего рост тех же тест-бактерий, 0,313 мкг/мл, то произведение 1024- 0,313=320 мкг/мл составляет концентрацию антибиотика в 1 мл.
Определение способности S. aureus продуцировать бета-лактамазу. В колбу с 0,5 мл суточной бульонной культуры стандартного штамма стафилококка, чувствительного к пенициллину, вносят 20 мл расплавленного и охлажденного до 45 °С питательного агара, перемешивают и выливают в чашку Петри. После застывания агара в центр чашки на поверхность среды помещают диск, содержащий пенициллин. По радиусам диска петлей засевают исследуемые культуры. Посевы инкубируют при 37 °С до следующего дня, после чего отмечают результаты опыта. О способности исследуемых бактерий продуцировать бета-лакта-мазу судят по наличию роста стандартного штамма стафилококка вокруг той или другой исследуемой культуры (вокруг диска).
38. Осложнения антибиотикотерапии, их предупреждение.
Как и всякие лекарственные средства, практически каждая группа антимикробных химиопрепаратов может оказывать побочное действие, причем и на макроорганизм, и на микробы, и на другие лекарственные средства.
Осложнения со стороны макроорганизма
Наиболее частыми осложнениями антимикробной химиотерапии являются:
Токсическое действие препаратов. Как правило, развитие этого осложнения зависит от свойств самого препарата, его дозы, способа введения, состояния больного и проявляется только при длительном и систематическом применении антимикробных химиотерапевтических препаратов, когда создаются условия для их накопления в организме. Особенно часто такие осложнения бывают, когда мишенью действия препарата являются процессы или структуры, близкие по составу или строению к аналогичным структурам клеток макроорганизма. Токсическому действию антимикробных препаратов особенно подвержены дети, беременные, а также пациенты с нарушением функций печени, почек.
Побочное токсическое влияние может проявляться как нейротоксическое (например, гликопептиды и аминогликозиды оказывают ототоксическое действие, вплоть до полной потери слуха за счет воздействия на слуховой нерв); нефротоксическое (полиены, полипептиды, аминогликозиды, макролиды, гликопептиды, сульфаниламиды); общетоксическое (противогрибковые препараты — полиены, имидазолы); угнетение кроветворения (тетрациклины, сульфаниламиды, левомицетин/хлорамфеникол, который содержит нитробензен — супрессор функции костного мозга); тератогенное [аминогликозиды, тетрациклины нарушают развитие костей, хрящей у плода и детей, формирование зубной эмали (коричневая окраска зубов), левомицетин/хлорамфеникол токсичен для новорожденных, у которых ферменты печени не полностью сформированы («синдром серого ребенка»), хинолоны — действуют на развивающуюся хрящевую и соединительную ткани].
Предупреждение осложнений состоит в отказе от противопоказанных данному пациенту препаратов, контроле за состоянием функций печени, почек и т. п.
Дисбиоз (дисбактериоз). Антимикробные химиопрепараты, особенно широкого спектра, могут воздействовать не только на возбудителей инфекций, но и на чувствительные микроорганизмы нормальной микрофлоры. В результате формируется дисбиоз, поэтому нарушаются функции ЖКТ, возникает авитаминоз и может развиться вторичная инфекция (в том числе эндогенная, например кандидоз, псевдомембранозный колит). Предупреждение последствий такого рода осложнений состоит в назначении, по возможности, препаратов узкого спектра действия, сочетании лечения основного заболевания с противогрибковой терапией (например, назначением нистатина), витаминотерапей, применением эубиотиков и т. п.
Отрицательное воздействие на иммунную систему. К этой группе осложнений относят прежде всего аллергические реакции. Причинами развития гиперчувствительности может быть сам препарат, продукты его распада, а также комплекс препарата с сывороточными белками. Возникновение такого рода осложнений зависит от свойств самого препарата, от способа и кратности его введения, индивидуальной чувствительности пациента к препарату. Аллергические реакции развиваются примерно в 10 % случаев и проявляются в виде сыпи, зуда, крапивницы, отека Квинке. Относительно редко встречается такая тяжелая форма проявления аллергии, как анафилактический шок. Такое осложнение чаще дают бета-лактамы (пенициллины), рифамицины. Сульфаниламиды могут вызвать гиперчувствительность замедленного типа. Предупреждение осложнений состоит в тщательном сборе аллергоанамнеза и назначении препаратов в соответствии с индивидуальной чувствительностью пациента. Кроме того, антибиотики обладают некоторым иммунодепрессивным действием и могут способствовать развитию вторичного иммунодефицита и ослаблению напряженности иммунитета.
Эндотоксический шок (терапевтический). Это явление, которое возникает при лечении инфекций, вызванных грамотрицательными бактериями. Введение антибиотиков вызывает гибель и разрушение клеток и высвобождение больших количеств эндотоксина. Это закономерное явление, которое сопровождается временным ухудшением клинического состояния больного.
Взаимодействие с другими препаратами. Антибиотики могут способствовать потенцированию действия или инактивации других препаратов (например, эритромицин стимулирует выработку ферментов печени, которые начинают ускоренно метаболизировать лекарственные средства разного назначения).
Побочное воздействие на микроорганизмы.
Применение антимикробных химиопрепа-ратов оказывает на микробы не только прямое угнетающее или губительное воздействие, но также может привести к формированию атипичных форм микробов (например, к образованию L-форм бактерий или изменению других свойств микробов, что значительно затрудняет диагностику инфекционных заболеваний) и персистирующих форм микробов. Широкое использование антимикробных лекарственных средств ведет также к формированию антибиотикозависимости (редко) и лекарственной устойчивости — антибиотикорезистентности (достаточно часто).
39. Бактериоцины и их характеристика.
Бактериоцины — специфические белки, вырабатываемые некоторыми бактериями и подавляющие жизнедеятельность клеток других штаммов того же вида или родственных видов бактерий. Бактериоцины обозначаются в соответствии с видовым названием, например Escherichia coli образует так называемые колицины, Pasteurella pestis — пестицины.
Механизм действия бактериоцинов связан с повреждением цитоплазматических мембран белком. Спектр активности бактериоцинов, в отличие от антибиотиков, узок и определяется наличием рецепторов у бактерий для их адсорбции.
40. Строение бактериального генома. Особенности взаимосвязи генотипа и фенотипа у прокариот. Современные представления о механизмах репликации ДНК у бактерий.
Бактериальный геном состоит из генетических элементов, способных к самостоятельной репликации, т. е. репликонов. Репликонами являются бактериальная хромосома и плазмиды.
Наследственная информация хранится у бактерий в форме последовательности нуклеотидов ДНК, которые определяют последовательность аминокислот в белке. Каждому белку соответствует свой ген, т. е. дискретный участок на ДНК, отличающийся числом и специфичностью последовательности нуклеотидов.
Бактериальная хромосома представлена одной двухцепочечной молекулой ДНК кольцевой формы. Размеры бактериальной хромосомы у различных представителей царства Procaryotae варьируют. Бактериальная хромосома формирует компактный нуклеоид бактериальной клетки. Бактериальная хромосома имеет гаплоидный набор генов. Она кодирует жизненно важные для бактериальной клетки функции.
Плазмиды бактерий представляют собой двухцепочечные молекулы ДНК. Они кодируют не основные для жизнедеятельности бактериальной клетки функции, но придающие бактерии преимущества при попадании в неблагоприятные условия существования.
Свойства микроорганизмов, как и любых других организмов, определяются их генотипом, т.е. совокупностью генов данной особи. Термин «геном» в отношении микроорганизмов — почти синоним понятия «генотип».
Фенотип представляет собой результат взаимодействия между генотипом и окружающей средой, т. е. проявление генотипа в конкретных условиях обитания. Фенотип микроорганизмов хотя и зависит от окружающей среды, но контролируется генотипом, так как характер и степень возможных для данной клетки стенотипических изменений определяются набором генов, каждый из которых представлен определенным участком молекулы ДНК.
В основе изменчивости лежит либо изменение реакции генотипа на факторы окружающей среды, либо изменение самого генотипа в результате мутации генов или их рекомбинации. В связи с этим фенотипическую изменчивость подразделяют на наследственную и ненаследственную.
Ненаследственная (средовая, модификационная) изменчивость обусловлена влиянием внутри- и внеклеточных факторов на проявление генотипа. При устранении фактора, вызвавшего модификацию, данные изменения исчезают.
Наследственная (генотипическая) изменчивость, связанная с мутациями, — мутационная изменчивость. Основу мутации составляют изменения последовательности нуклеотидов в ДНК, полная или частичная их утрата, т. е. происходит структурная перестройка генов, проявляющаяся фенотипически в виде измененного признака.
Наследственная изменчивость, связанная с рекомбинациями, называется рекомбинационной изменчивостью.
Подвижные генетические элементы.
В состав бактериального генома, как в бактериальную хромосому, так и в плазмиды, входят подвижные генетические элементы. К подвижным генетическим элементам относятся вставочные последовательности и транспозоны.
Вставочные (инсерционные) последовательности IS-элементы — это участки ДНК, способные как целое перемещаться из одного участка репликона в другой, а также между репликонами. Они содержат лишь те гены, которые необходимы для их собственного перемещения — транспозиции: ген, кодирующий фермент транспозазу, обеспечивающую процесс исключения IS-элемента из ДНК и его интеграцию в новый локус, и ген, детерминирующий синтез репрессора, который регулирует весь процесс перемещения.
Отличительной особенностью IS-элементов является наличие на концах вставочной последовательности инвертированных повторов. Эти инвертированные повторы узнает фермент транспозаза. Транспозаза осуществляет одноцепочечные разрывы цепей ДНК, расположенных по обе стороны от подвижного элемента. Оригинальная копия IS-элемента остается на прежнем месте, а ее реплицированный дупликат перемещается на новый участок.
Перемещение подвижных генетических элементов принято называть репликативной или незаконной рекомбинацией. Однако в отличие от бактериальной хромосомы и плазмид подвижные генетические элементы не являются самостоятельными репликонами, так как их репликация — составной элемент репликации ДНК репликона, в составе которого они находятся.
Известно несколько разновидностей IS-элементов, которые различаются по размерам и по типам и количеству инвертированных повторов.
Транспозоны — это сегменты ДНК, обладающие теми же свойствами, что и IS-элементы, но имеющие структурные гены, т. е. гены, обеспечивающие синтез молекул, обладающих специфическим биологическим свойством, например токсичностью, или обеспечивающих устойчивость к антибиотикам.
Перемещаясь по репликону или между репликонами, подвижные генетические элементы вызывают:
1. Инактивацию генов тех участков ДНК, куда они, переместившись, встраиваются.
2. Образование повреждений генетического материала.
3. Слияние репликонов, т. е. встраивание плазмиды в хромосому.
4. Распространение генов в популяции бактерий, что может приводить к изменению биологических свойств популяции, смене возбудителей инфекционных заболеваний, а также способствует эволюционным процессам среди микробов.
Изменения бактериального генома, а следовательно, и свойств бактерий могут происходить в результате мутаций и рекомбинаций.
Плазмиды — внехромосомные мобильные генетические структуры бактерий, представляющие собой замкнутые кольца двунитчатой ДНК. По размерам составляют 0,1—5 % ДНК хромосомы. Плазмиды способны автономно копироваться (реплицироваться) и существовать в цитоплазме клетки, поэтому в клетке может быть несколько копий плазмид. Плазмиды могут включаться (интегрировать) в хромосому и реплицироваться вместе с ней. Различают трансмиссивные и нетрансмиссивные плазмиды. Трансмиссивные (конъюгативные) плазмиды могут передаваться из одной бактерии в другую.
Среди фенотипических признаков, сообщаемых бактериальной клетке плазмидами, можно выделить следующие:
1) устойчивость к антибиотикам;
2) образование колицинов;
3) продукция факторов патогенности;
4) способность к синтезу антибиотических веществ;
5) расщепление сложных органических веществ;
6) образование ферментов рестрикции и модификации.
Термин «плазмиды» впервые введен американским ученым Дж. Ледербергом (1952) для обозначения полового фактора бактерий. Плазмиды несут гены, не обязательные для клетки-хозяина, придают бактериям дополнительные свойства, которые в определенных условиях окружающей среды обеспечивают их временные преимущества по сравнению с бесплазмидными бактериями.
Некоторые плазмиды находятся под строгим контролем. Это означает, что их репликация сопряжена с репликацией хромосомы так, что в каждой бактериальной клетке присутствует одна или, по крайней мере, несколько копий плазмид.
Число копий плазмид, находящихся под слабым контролем, может достигать от 10 до 200 на бактериальную клетку.
Для характеристики плазмидных реплико-нов их принято разбивать на группы совместимости. Несовместимость плазмид связана с неспособностью двух плазмид стабильно сохраняться в одной и той же бактериальной клетке. Несовместимость свойственна тем плазмидам, которые обладают высоким сходством репликонов, поддержание которых в клетке регулируется одним и тем же механизмом.
Некоторые плазмиды могут обратимо встраиваться в бактериальную хромосому и функционировать в виде единого репликона. Такие плазмиды называются интегративными или эписомами.
У бактерий различных видов обнаружены R-плазмиды, несущие гены, ответственные за множественную устойчивость к лекарственным препаратам — антибиотикам, сульфаниламидам и др., F-плазмиды, или половой фактор бактерий, определяющий их способность к конъюгации и образованию половых пилей, Ent-плазмиды, детерминирующие продукцию энтеротоксина.
Плазмиды могут определять вирулентность бактерий, например возбудителей чумы, столбняка, способность почвенных бактерий использовать необычные источники углерода, контролировать синтез белковых антибиотикоподобных веществ — бактериоцинов, детерминируемых плазмидами бактериоциногении, и т. д. Существование множества других плазмид у микроорганизмов позволяет полагать, что аналогичные структуры широко распространены у самых разнообразных микроорганизмов.
Плазмиды подвержены рекомбинациям, мутациям, могут быть элиминированы (удалены) из бактерий, что, однако, не влияет на их основные свойства. Плазмиды являются удобной моделью для экспериментов по искусственной реконструкции генетического материала, широко используются в генетической инженерии для получения рекомбинантных штаммов. Благодаря быстрому самокопированию и возможности конъюгаци-онной передачи плазмид внутри вида, между видами или даже родами плазмиды играют важную роль в эволюции бактерий.
Изменчивость у бактерий может носить фенотипический (модификации) или генотипический (мутации) характер.
Модификации представляют собой фенотипические ненаследуемые изменения, возникающие при действии ряда факторов на генетически однородные микроорганизмы.
Мутации характеризуются наследуемыми изменениями в генетическом аппарате микроорганизма и, соответственно, в его биологических свойствах. Спонтанные мутации могут иметь неблагоприятный исход для микроба. Вместе с тем, мутационная изменчивость в сочетании с методами селекции открывает широкие возможности для поиска полезных микроорганизмов. Применение мутагенов позволило получить высокоактивные продуценты антибиотиков и аминокислот. Методами отбора были созданы живые вакцины против полиомиелита, кори, туберкулеза и др.
К рекомбинационным видам изменчивости у бактерий относятся трансформация, конъюгация и трансдукция.
Трансформация – это процесс переноса генетической информации бактерии-реципиенту с помощью ДНК бактерии-донора. Этим генетическим приемом можно передать вирулентность, устойчивость к антибиотикам, способность синтезировать различные вещества и др.
Трансдукция – это процесс переноса генетической информации от бактерии-реципиента клетке-донору с помощью бактериофага, например, способности синтезировать какой-либо фермент.
Конъюгация – процесс, при котором передача генетического материала происходит при непосредственном контакте двух микробных клеток. При этом из бактерии-донора (F+ или Hfr) в бактерию-реципиент переходит F-плазмида (нехромосомный фактор наследственности в виде короткой цепочки ДНК), которая придает бактерии-реципиенту новое свойство, например, устойчивость к антибиотикам, способность продуцировать определенные аминокислоты, белки, факторы роста и т.д. Метод конъюгации создает широкие перспективы для создания рекомбинантных культур микроорганизмов, применяемых для получения лекарственных средств. В настоящее время сконструированы штаммы Е. coli, в геном которых встроены гены, контролирующие синтез интерферона, инсулина, других гормонов. В геном дрожжей введен ген вируса гепатита В, ответственный за выработку иммуногенного HBsAg, что использовано для производства генно-инженерной вакцины для профилактики этого заболевания.
Конъюгация бактерий состоит в переходе генетического материала (ДНК) из клетки-донора («мужской») в клетку-реципиент («женскую») при контакте клеток между собой.
Мужская клетка содержит F-фактор, или половой фактор, который контролирует синтез так называемых половых пилей, или F-пилей. Клетки, не содержащие F-фактора, являются женскими; при получении F-фактора они превращаются в «мужские» и сами становятся донорами. F-фактор располагается в цитоплазме в виде кольцевой двунитчатой молекулы ДНК, т. е. является плазмидой. Молекула F-фактора значительно меньше хромосомы и содержит гены, контролирующие процесс конъюгации, в том числе синтез F-пилей. При конъюгации F-пили соединяют «мужскую» и «женскую» клетки, обеспечивая переход ДНК через конъюгационный мостик или F-пили. Клетки, содержащие F-фактор в цитоплазме, обозначаются F+; они передают F-фактор клеткам, обозначаемым F" («женским»), не утрачивая донорской способности, так как оставляют копии F-фактора. Если F-фактор включается в хромосому, то бактерии приобретают способность передавать фрагменты хромосомной ДНК и называются Hfr-клетками (от англ. high frequency of recombination — высокая частота рекомбинаций), т.е. бактериями с высокой частотой рекомбинаций. При конъюгации клеток Hfr и клеток F" хромосома разрывается и передается с определенного участка (начальной точки) в клетку F", продолжая реплицироваться. Перенос всей хромосомы может длиться до 100 мин.
Переносимая ДНК взаимодействует с ДНК реципиента — происходит гомологичная рекомбинация. Прерывая процесс конъюгации бактерий, можно определять последовательность расположения генов в хромосоме. Иногда F-фактор может при выходе из хромосомы захватывать небольшую ее часть, образуя так называемый замещенный фактор — F'.
При конъюгации происходит только частичный перенос генетического материала, поэтому ее не следует отождествлять полностью с половым процессом у других организмов.
Трансдукция — передача ДНК от бактерии-донора к бактерии-реципиенту при участии бактериофага. Различают неспецифическую (общую) трансдукцию, при которой возможен перенос любого фрагмента ДНК донора, и специфическую — перенос определенного фрагмента ДНК донора только в определенные участки ДНК реципиента. Неспецифическая трансдукция обусловлена включением ДНК донора в головку фага дополнительно к геному фага или вместо генома фага (дефектные фаги). Специфическая трансдукция обусловлена замещением некоторых генов фага генами хромосомы клетки-донора. Фаговая ДНК, несущая фрагменты хромосомы клетки-донора, включается в строго определенные участки хромосомы клетки-реципиента. Таким образом, привносятся новые гены и ДНК фага в виде профага репродуцируется вместе с хромосомой, т.е. этот процесс сопровождается лизоге-нией. Если фрагмент ДНК, переносимый фагом, не вступает в рекомбинацию с хромосомой реципиента и не реплицируется, но с него считывается информация о синтезе соответствующего продукта, такая трансдукция называется абортивной.
Трансформация заключается в том, что ДНК, выделенная из бактерий в свободной растворимой форме, передается бактерии-реципиенту. При трансформации рекомбинация происходит, если ДНК бактерий родственны друг другу. В этом случае возможен обмен гомологичных участков собственной и проникшей извне ДНК. Впервые явление трансформации описал Ф. Гриффите (1928). Он вводил мышам живой невирулентный бескапсульный R-штамм пневмококка и одновременно убитый вирулентный капсульный S-штамм пневмококка. Из крови погибших мышей был выделен вирулентный пневмококк, имеющий капсулу убитого S-штамма пневмококка. Таким образом, убитый S-штамм пневмококка передал наследственную способность капсулообразования R-штамму пневмококка. О. Эвери, К. Мак-Леод и М. Мак-Карти (1944) доказали, что трансформирующим агентом в этом случае является ДНК. Путем трансформации могут быть перенесены различные признаки: капсулообразование, устойчивость к антибиотикам, синтез ферментов.
Изучение бактериальной трансформации позволило установить роль ДНК как материального субстрата наследственности. При изучении генетической трансформации у бактерий были разработаны методы экстракции и очистки ДНК, биохимические и биофизические методы ее анализа.
44. Бактериофаг. Понятие о вирулентных и умеренных фагах. Классификация, механизмы взаимодействия бактериофага с клеткой. Лизогения и лизогенная конверсия.
Бактериофаги — вирусы бактерий, обладающие способностью специфически проникать в бактериальные клетки, репродуцироваться в них и вызывать их растворение (лизис).
Взаимодействие фага с бактериальной клеткой. По механизму взаимодействия различают вирулентные и умеренные фаги.
Вирулентные фаги, проникнув в бактериальную клетку, автономно репродуцируются в ней и вызывают лизис бактерий. Процесс взаимодействия вирулентного фага с бактерией протекает в виде нескольких стадий и весьма схож с процессом взаимодействия вирусов человека и животных с клеткой хозяина. Однако для фагов, имеющих хвостовой отросток с сокращающимся чехлом, он имеет особенности. Эти фаги адсорбируются на поверхности бактериальной клетки с помощью фибрилл хвостового отростка. В результате активации фагового фермента АТФазы происходит сокращение чехла хвостового отростка и внедрение стержня в клетку. В процессе «прокалывания» клеточной стенки бактерии принимает участие фермент лизоцим, находящийся на конце хвостового отростка. Вслед за этим ДНК фага, содержащаяся в головке, проходит через полость хвостового стержня и активно впрыскивается в цитоплазму клетки. Остальные структурные элементы фага (капсид и отросток) остаются вне клетки.
После биосинтеза фаговых компонентов и их самосборки в бактериальной клетке накапливается до 200 новых фаговых частиц. Под действием фагового лизоцима и внутриклеточного осмотического давления происходит разрушение клеточной стенки, выход фагового потомства в окружающую среду и лизис бактерии. Один литический цикл (от момента адсорбции фагов до их выхода из клетки) продолжается 30—40 мин. Процесс бактериофагии проходит несколько циклов, пока не будут лизированы все чувствительные к данному фагу бактерии.
Взаимодействие фагов с бактериальной клеткой характеризуется определенной степенью специфичности. По специфичности действия различают поливалентные фаги, способные взаимодействовать с родственными видами бактерий, моновалентные фаги, взаимодействующие с бактериями определенного вида, и типовые фаги, взаимодействующие с отдельными вариантами (типами) данного вида бактерий.
Умеренные фаги лизируют не все клетки в популяции, с частью из них они вступают в симбиоз, в результате чего ДНК фага встраивается в хромосому бактерии. В таком случае геномом фага называют профаг. Профаг, ставший частью хромосомы клетки, при ее размножении реплицируется синхронно с геном бактерии, не вызывая ее лизиса, и передается по наследству от клетки к клетке неограниченному числу потомков.
Биологическое явление симбиоза микробной клетки с умеренным фагом (профагом) называется лизогенией, а культура бактерий, содержащая профаг, получила название лизогенной. Это название отражает способность профага самопроизвольно или под действием ряда физических и химических факторов исключаться из хромосомы клетки и переходить в цитоплазму, т. е. вести себя как вирулентный фаг, лизирующий бактерии.
Лизогенные культуры по своим основным свойствам не отличаются от исходных, но они невосприимчивы к повторному заражению гомологичным или близкородственным фагом и, кроме того, приобретают дополнительные свойства, которые находятся под контролем генов профага. Изменение свойств микроорганизмов под влиянием профага получило название фаговой конверсии. Последняя имеет место у многих видов микроорганизмов и касается различных их свойств: культуральных, биохимических, токсигенных, антигенных, чувствительности к антибиотикам и др. Кроме того, переходя из интегрированного состояния в вирулентную форму, умеренный фаг может захватить часть хромосомы клетки и при лизисе последней переносит эту часть хромосомы в другую клетку. Если микробная клетка станет лизогенной, она приобретает новые свойства. Таким образом, умеренные фаги являются мощным фактором изменчивости микроорганизмов.
45. Трансдукция. Понятия профаг, дефектный фаг.
Трансдукция — передача ДНК от бактерии-донора к бактерии-реципиенту при участии бактериофага. Различают неспецифическую (общую) трансдукцию, при которой возможен перенос любого фрагмента ДНК донора, и специфическую — перенос определенного фрагмента ДНК донора только в определенные участки ДНК реципиента. Неспецифическая трансдукция обусловлена включением ДНК донора в головку фага дополнительно к геному фага или вместо генома фага (дефектные фаги). Специфическая трансдукция обусловлена замещением некоторых генов фага генами хромосомы клетки-донора. Фаговая ДНК, несущая фрагменты хромосомы клетки-донора, включается в строго определенные участки хромосомы клетки-реципиента. Таким образом, привносятся новые гены и ДНК фага в виде профага репродуцируется вместе с хромосомой, т.е. этот процесс сопровождается лизоге-нией. Если фрагмент ДНК, переносимый фагом, не вступает в рекомбинацию с хромосомой реципиента и не реплицируется, но с него считывается информация о синтезе соответствующего продукта, такая трансдукция называется абортивной.
В таком случае геномом фага называют профаг. Профаг, ставший частью хромосомы клетки, при ее размножении реплицируется синхронно с геном бактерии, не вызывая ее лизиса, и передается по наследству от клетки к клетке неограниченному числу потомков.
Дефектный фаг (defective phage) [лат. defectus — изъян, недостаток и греч. phagos — пожирающий] — бактериофаг, не способный размножаться в специфичной для него клетке-хозяине без присутствия другого фага — фага-помощника.
46. Практическое применение фагов в медицине.
Практическое применение фагов. Бактериофаги используют в лабораторной диагностике инфекций при внутривидовой идентификации бактерий, т. е. определении фаговара (фаготипа). Для этого применяют метод фаготипирования, основанный на строгой специфичности действия фагов: на чашку с плотной питательной средой, засеянной «газоном» чистой культурой возбудителя, наносят капли различных диагностических типоспецифических фагов. Фаговар бактерии определяется тем типом фага, который вызвал ее лизис (образование стерильного пятна, «бляшки», или «негативной колонии», фага). Методику фаготипирования используют для выявления источника и путей распространения инфекции (эпидемиологическое маркирование). Выделение бактерий одного фаговара от разных больных указывает на общий источник их заражения.
По содержанию бактериофагов в объектах окружающей среды (например, в воде) можно судить о присутствии в них соответствующих патогенных бактерий. Подобные исследования проводят при эпидемиологическом анализе вспышек инфекционных болезней.
Фаги применяют также для лечения и профилактики ряда бактериальных инфекций. Производят брюшнотифозный, сальмонеллезный, дизентерийный, синегнойный, стафилококковый, стрептококковый фаги и комбинированные препараты (колипротейный, пиобактериофаги и др). Бактериофаги назначают по показаниям перорально, парентерально или местно в виде жидких, таблети-рованных форм, свечей или аэрозолей.
Бактериофаги широко применяют в генной инженерии и биотехнологии в качестве векторов для получения рекомбинантных ДНК.
47. Генная инженерия и биотехнология
Биотехнология представляет собой область знаний, которая возникла и оформилась на стыке микробиологии, молекулярной биологии, генетической инженерии, химической технологии и ряда других наук. Рождение биотехнологии обусловлено потребностями общества в новых, более дешевых продуктах для народного хозяйства, в том числе медицины и ветеринарии, а также в принципиально новых технологиях. Биотехнология — это получение продуктов из биологических объектов или с применением биологических объектов. В качестве биологических объектов могут быть использованы организмы животных и человека (например, получение иммуноглобулинов из сывороток вакцинированных лошадей или людей; получение препаратов крови доноров), отдельные органы (получение гормона инсулина из поджелудочных желез крупного рогатого скота и свиней) или культуры тканей (получение лекарственных препаратов). Однако в качестве биологических объектов чаще всего используют одноклеточные микроорганизмы, а также животные и растительные клетки.
Клетки животных и растений, микробные клетки в процессе жизнедеятельности (ассимиляции и диссимиляции) образуют новые продукты и выделяют метаболиты, обладающие разнообразными физико-химическими свойствами и биологическим действием.
Биотехнология использует эту продукцию клеток как сырье, которое в результате технологической обработки превращается в конечный продукт. С помощью биотехнологии получают множество продуктов, используемых в различных отраслях:
• медицине (антибиотики, витамины, ферменты, аминокислоты, гормоны, вакцины, антитела, компоненты крови, диагностические препараты, иммуномодуляторы, алкалоиды, пищевые белки, нуклеиновые кислоты, нуклеозиды, нуклеоти-ды, липиды, антиметаболиты, антиоксиданты, противоглистные и противоопухолевые препараты);
• ветеринарии и сельском хозяйстве (кормовой белок: кормовые антибиотики, витамины, гормоны, вакцины, биологические средства защиты растений, инсектициды);
• пищевой промышленности (аминокислоты, органические кислоты, пищевые белки, ферменты, липиды, сахара, спирты, дрожжи);
• химической промышленности (ацетон, этилен, бутанол);
• энергетике (биогаз, этанол).
Следовательно, биотехнология направлена на создание диагностических, профилактических и лечебных медицинских и ветеринарных препаратов, на решение продовольственных вопросов (повышение урожайности, продуктивности животноводства, улучшение качества пищевых продуктов — молочных, кондитерских, хлебобулочных, мясных, рыбных); на обеспечение многих технологических процессов в легкой, химической и других отраслях промышленности. Необходимо отметить также все возрастающую роль биотехнологии в экологии, так как очистка сточных вод, переработка отходов и побочных продуктов, их деградация (фенол, нефтепродукты и другие вредные для окружающей среды вещества) осуществляются с помощью микроорганизмов.
В настоящее время в биотехнологии выделяют медико-фармацевтическое, продовольственное, сельскохозяйственное и экологическое направления. В соответствии с этим биотехнологию можно разделить на медицинскую, сельскохозяйственную, промышленную и экологическую. Медицинская в свою очередь подразделяется на фармацевтическую и иммунобиологическую, сельскохозяйственная — на ветеринарную и биотехнологию растений, а промышленная — на соответствующие отраслевые направления (пищевая, легкая промышленность, энергетика и т. д.).
Биотехнологию также подразделяют на традиционную (старую) и новую. Последнюю связывают с генетической инженерией. Общепризнанное определение предмета «биотехнология» отсутствует и даже ведется дискуссия о том, наука это или производство.
48. Генетическая основа молекулярно-биологических методов диагностики (плазмидный профиль, рестрикционный анализ, риботипирование, использование микрочипов.)
Рестрикционный анализ. Данный метод основан на применении ферментов, носящих название рестриктаз. Рестриктазы представляют собой эндонук-леазы, которые расщепляют молекулы ДНК, разрывая фосфатные связи не в произвольных местах, а в определенных последовательностях нуклеотидов. Особое значение для методов молекулярной генетики имеют рестриктазы, которые узнают последовательности, обладающие центральной симметрией и считывающиеся одинаково в обе стороны от оси симметрии. Точка разрыва ДНК может или совпадать с осью симметрии, или быть сдвинута относительно нее.
В настоящее время из различных бактерий выделено и очищено более 175 различных рестриктаз, для которых известны сайты (участки) узнавания (рестрикции). Выявлено более 80 различных типов сайтов, в которых может происходить разрыв двойной спирали ДНК.
В геноме конкретной таксономической единицы находится строго определенное (генетически задетерминированное) число участков узнавания для определенной рестриктазы.
Если выделенную из конкретного микроба ДНК обработать определенной рестриктазой, то это приведет к образованию строго определенного количества фрагментов ДНК фиксированного размера.
Размер каждого типа фрагментов можно узнать с помощью электрофореза в агарозном геле: мелкие фрагменты перемещаются в геле быстрее, чем более крупные фрагменты, и длина их пробега больше. Гель окрашивают бромистым этидием и фотографируют в УФ-излучении. Таким образом можно получить рестрикционную карту определенного вида микробов.
Сопоставляя карты рестрикции ДНК, выделенных из различных штаммов, можно определить их генетическое родство, выявить принадлежность к определенному виду или роду, а также обнаружить участки, подвергнутые мутациям.
Этот метод используется также как начальный этап метода определения последовательности нуклеотидных пар (секвенирования) и метода молекулярной гибридизации.
Метод молекулярной гибридизации позволяет выявить степень сходства различных ДНК. Применяется при идентификации микробов для определения их точного таксономического положения.
Метод основан на способности двухцепочечной ДНК при повышенной температуре (90 °С) в щелочной среде денатурировать, т. е. расплетаться на две нити, а при понижении температуры на 10 °С вновь восстанавливать исходную двухцепочечную структуру. Метод требует наличия молекулярного зонда.
Зондом называется одноцепочечная молекула нуклеиновой кислоты, меченная радиоактивными нуклидами, с которой сравнивают исследуемую ДНК.
Для проведения молекулярной гибридизации исследуемую ДНК расплетают указанным выше способом, одну нить фиксируют на специальном фильтре, который затем помещают в раствор, содержащий радиоактивный зонд. Создаются условия, благоприятные для образования двойных спиралей. В случае наличия комплементарности между зондом и исследуемой ДНК, они образуют между собой двойную спираль.
Риботипирование и опосредованная транскрипцией амплификация рибосомальной РНК. Последовательность нуклеотидных оснований в оперонах, кодирующих рРНК, отличается консервативностью, присущей каждомувиду бактерий. Эти опероны представлены на бактериальной хромосоме в нескольких копиях. Фрагменты ДНК, полученные после обработки ее рестриктазами, содержат последовательности генов рРНК, которые могут быть обнаружены методом молекулярной гибридизации с меченой рРНК соответствующего виды бактерий. Количество и локализация копий оперонов рРНК и рестрикционный состав сайтов как внутри рРНК-оперона, так и по его флангам варьируют у различных вида бактерий. На основе этого свойства построен метод риботипирования, который позволяет производить мониторинг выделенных штаммов и определение их вида. В настоящее время риботипирование проводится в автоматическом режиме в специальных приборах.
Опосредованная транскрипцией амплификация рРНК используется для диагностики смешанных инфекций. Этот метод основан на обнаружении с помощью молекулярной гибридизации амплифицированных рРНК, специфичных для определенного вида бактерий. Исследование проводится в три этапа:
1. Амплификация пула рРНК на матрице выделенной из исследуемого материала ДНК при помощи ДНК-зависимой РНК-полимеразы.
2. Гибридизация накопленного пула рРНК с комплементарными видоспецифическим рРНК олигонуклеотидами, меченными флюорохромом или ферментами.
3. Определение продуктов гибридизации методами денситометрии, иммунофермент-ного анализа (ИФА).
Реакция проводится в автоматическом режиме в установках, в которых одномоментное определение рРНК, принадлежащих различным видам бактерий, достигается разделением амплифицированного пула рРНК на несколько проб, в которые вносятся комплементарные видоспецифическим рРНК меченые олигонуклеотиды для гибридизации.
49. Полимеразная цепная реакция и ее разновидности (в реальном времени, branch-PCR и др.)
Полимеразная цепная реакция позволяет обнаружить микроб в исследуемом материале (воде, продуктах, материале от больного) по наличию в нем ДНК микроба без выделения последнего в чистую культуру.
Для проведения этой реакции из исследуемого материала выделяют ДНК, в которой определяют наличие специфичного для данного микроба гена. Обнаружение гена осуществляют его накоплением. Для этого необходимо иметь праймеры комплементарного З'-концам ДНК. исходного гена. Накопление (амплификация) гена выполняется следующим образом. Выделенную из исследуемого материала ДНК нагревают. При этом ДНК распадается на 2 нити. Добавляют праймеры. Смесь ДНК и праймеров охлаждают. При этом праймеры, при наличии в смеси ДНК искомого гена, связываются с его комплементарными участками. Затем к смеси ДНК и праймера добавляют ДНК-полимеразу и нуклеотиды. Устанавливают температуру, оптимальную для функционирования ДНК-полимеразы. В этих условиях, в случае комплементарное™ ДНК гена и праймера, происходит присоединение нуклеотидов к З'-концам праймеров, в результате чего синтезируются две копии гена. После этого цикл повторяется снова, при этом количество ДНК гена будет увеличиваться каждый раз вдвое. Проводят реакцию в специальных приборах — амплификаторах. ПЦР применяется для диагностики вирусных и бактериальных инфекций.
3. Полимеразная цепная реакция (ПЦР). Метод ПЦР позволяет обнаруживать уникальные (специфические) участки ДНК, находящиеся в исследуемом образце в очень малых количествах. Сущность ПЦР основана на амплификации (увеличении) числа копий искомого участка генома микроорганизма, причем для идентификации вида микроорганизма теоретически достаточно одной копии искомой уникальной последовательности. С этой целью образец инкубируют в буферном растворе с двумя короткими ДНК-олигомерами (праймерами), комплементарными концам известного уникального фрагмента генома, термостабильной ДНК-полимеразой и нуклеотидами. После гибридизации олигомеров с комплементарными участками ДНК они служат праймерами для полимеразы, которая копирует искомый фрагмент. Образец многократно (20-40 раз) нагревают для разделения цепей двойной спирали ДНК и охлаждают для повторной гибридизации праймеров с комплементарной матрицей, при этом каждая копия участка ДНК становится новой матрицей для синтеза следующей копии. Количество копий искомого фрагмента генома в результате амплификации в специальном приборе – амплификаторе (рис. 27, см. приложение) экспоненциально увеличивается. Амплификация в миллионы раз занимает всего несколько часов. Определение амплифицированной ДНК осуществляется либо электрофорезом в геле с помощью специального оборудования (рис. 28, см. приложение) с последующим окрашиванием пробы флюоресцентным красителем и регистрацией результатов электрофореза в приборе – трансиллюминаторе (рис. 29, см. приложение), либо флюориметрическим методом (в этом случае зонды и/или праймеры имеют флюоресцентную метку, которая учитывается на приборе- флюориметре – рис 30, см. приложение).
ПЦР широко используется в диагностических целях. Достоинства ПЦР как метода диагностики инфекционных заболеваний заключаются в следующем:
1. ПЦР дает прямые указания на присутствие возбудителя в исследуемом материале без выделения чистой культуры.
2. Метод обладает очень высокой чувствительностью (от нескольких до одного возбудителя в пробе) и 100% специфичностью. Количество исследуемого материала может составлять несколько десятков микролитров.
3. Исследуемый материал может быть дезинфицирован с помощью химических или термических методов, что исключает инфицирование персонала в процессе проведения ПЦР.
50. Экология микроорганизмов.
Важнейшим объектом изучения экологической микробиологии является микробиоценоз. В естественных средах (почва, вода, воздух, живые организмы) микроорганизмы живут в виде сообществ, образуя экологические связи как между собой, так и с растениями, животными и человеком, а также с абиогенными факторами окружающей среды
Популяции микроорганизмов состоят из особей одного вида, который характеризуется leiepoieHnocTbK), так как содержит различные варианты Отношения между ними носят преимущественно симбиотический характер, хотя в некоторых случаях, например при разных темпах размножения в среде с лимитирующим источником питания, имеет место конкуренция.
Межвидовые взаимоотношения сложны, многообразны и динамичны. Они могут быть разделены на несколько видов
Нейтрализм - форма межвидовых отношений, при которой обитающие в одном биотопе популяции не оказываю! друг на друга ни стимулирующего, ни подавляющего действия.
При симбиозе обе популяции извлекают для себя пользу. Степень взаимозависимости симбионтов варьирует от слабой (сотрудничество) до полной (мутуализм). Мутуализм наблюдается в тех случаях, когда симбионты выполняют разные дополняющие друг друга жизненные функции. Например, одна популяция синтезирует продукт, которой является основой питания для другой популяции Симбиоз наблюдается между аэробами и анаэробами, организмом человека и его собственной (аутохтон-ной) микрофлорой.
Содержание явления коменсализм хорошо отражает его русский синоним нахлебничество. Коменсалы питаются остатками пищи хозяина, которые в его рационе не имеют значения. Например, комеисалы человека — аутохтонные бактерии и грибы, питающиеся спущенным эпителием или остатками органических веществ.
При конкуренци и, или антагонизме, происходит подавление жизнедеятельности одной популяции другой. Антагонисты обладают способностью выделять в среду обитания вещества, которые вызывают задержку размножения или гибель компонента микробиоза. К таким веществам относятся антибиотики, бактериоцины, органические и жирные кислоты и др.
Паразитизм — такой вид межвидовых связей, при котором одна популяция (паразит), нанося вред другой популяции (хозяину), извлекает для себя пользу. Паразитами бактерий являются фаги. К микробам-паразитам человека относятся бактерии, вирусы, грибы, простейшие
51. Санитарно-показательные микроорганизмы и их свойства.
Санитарная микробиология — раздел медицинской микробиологии, изучающий микроорганизмы, содержащиеся в окружающей среде и способные оказывать неблагоприятное воздействие на состояние здоровья человека. Она разрабатывает микробиологические; показатели гигиенического нормирования, методы контроля за эффективностью обеззараживания объектов окружающей среды, а также выявляет в объектах окружающей среды патогенные, условно-патогенные и санитарно-показательные микроорганизмы.
Санитарно-показательные микроорганизмы используют в основном для косвенного определения возможного присутствия в объектах окружающей среды патогенных микроорганизмов. Их наличие свидетельствует о загрязнении объекта выделениями человека и животных, так как они постоянно обитают в тех же органах, что и возбудители заболеваний, и имеют общий путь выделения в окружающую среду. Например, возбудители кишечных инфекций имеют общий путь выделения (с фекалиями) с такими санитарно-показательными бактериями, как бактерии группы кишечной палочки —(в группу входят сходные по свойствам бактерии родов Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella), энтерококки, клостридии перфрингенс. Возбудители воздушно-капельных инфекций имеют общий путь выделения с бактериями (кокками), постоянно обитающими на слизистой оболочке верхних дыхательных путей, выделяющимися в окружающую среду (при кашле, чиханье, разговоре), поэтому в качестве санитарно-показательных бактерий для воздуха закрытых помещений предложены гемолитические стрептококки и золотистые стафилококки. Санитарно-показательные микроорганизмы должны отвечать следующим основным требованиям:
1. должны обитать только в организме людей или животных и постоянно обнаруживаться в их выделениях;
2. не должны размножаться или обитать в почве и воде;
3. сроки их выживания и устойчивость к различным факторам после выделения из организма в окружающую среду должны быть равными или превышать таковые у патогенных микробов;
4. их свойства должны быть типичными и легко выявляемыми для их дифференциации;
5. методы их обнаружения и идентификации должны быть простыми, методически и экономически доступными;
6. должны встречаться в окружающей среде в значительно больших количествах, чем патогенные микроорганизмы;
7. в окружающей среде не должно быть близко сходных обитателей — микроорганизмов.
52. Распространение микробов в окружающей среде. Микрофлора почвы, воды, воздуха, бытовых и медицинских объектов. Санитарно-бактериологическое исследование продуктов детского питания.
Микробы широко распространены в природе, используя для своего питания различные органические и даже минеральные вещества. Важными факторами, обеспечивающими широкое распространение микроорганизмов во внешней среде, являются их высокая скорость размножения, значительная устойчивость к неблагоприятным факторам внешней среды и высокая приспособляемость к меняющимся условиям обитания. Почва, вода и воздух могут служить источником микробного загрязнения продуктов питания, лекарственного сырья и препаратов, производственных помещений аптек, а также источником заражения людей патогенными микроорганизмами. Как правило, представители нормальной микрофлоры почвы, воды и воздуха не являются патогенными для человека. Основными путями попадания патогенных микроорганизмов от больных людей и носителей микробов в окружающую среду являются фекальный и воздушно-капельный.
Точное количественное определение бактерий (в том числе болезнетворных) в воде и других объектах внешней среды (почва, пищевые продукты, лекарственные препараты и др.) представляет значительные трудности в связи с невозможностью создания оптимальных условия для размножения всех встречающихся в исследуемом материале микроорганизмов, а также из-за различий их биологических свойств, низкой концентрацией, временным пребыванием и трудоемкостью исследований. Поэтому о загрязненности внешней среды выделениями человека судят по обнаружению в ней санитарно-показательных микроорганизмов. Эти микробы являются постоянными представителями нормальной микрофлоры организма человека и теплокровных животных, не находятся в других природных резервуарах или не имеют других естественных мест обитания. Санитарно-показательные микроорганизмы сохраняются жизнеспособными в окружающей среде в течение времени, сравнимого со сроками выживания отдельных видов патогенных бактерий, выделяющихся из организма теми же путями, они не способны интенсивно размножаться в окружающей среде и их количество остается постоянным определенный период времени после попадания в окружающую среду. Виды санитарно-показательных микроорганизмы, их количество и биологические свойства доступны для определения с помощью классических микробиологических методов.
Санитарно-показательными микроорганизмами для воды являются Е. coli, S. faecalis; для почвы - Е. coli, S. faecalis, С. perfringens; для воздуха - S. haemolyticus, S. viridans, S. aureus; для предметов обихода - E. coli, S. faecalis, S. аureus. Показателями фекального загрязнения среды служат E.coli, S.faecalis, C.perfringens; показателями орально-капельного загрязнения— S. viridans, S. haemolyticus и S. aureus. Сроки выживания в объектах окружающей среды Е. coli совпадают со сроками выживания патогенных кишечных бактерий. С. perfringens присутствуют в окружающей среде наиболее длительно. Присутствие S. faecalis является показателем свежей фекальной загрязненности. Если С. регfringens обнаруживается без Е. coli, то это свидетельствует о старом фекальном загрязнении среды.
Количественные характеристики микробной загрязненности почвы, воды и других объектов оцениваются по данным определения коли- и перфрингенс-индекса - количества клеток кишечной палочки или С. perfringens в 1 л воды или 1 г почвы.
Микрофлора почвы. Почва, содержащая различные органические соединения, является благоприятной средой для существования многих видов микроорганизмов и главным резервуаром микробов в природе. Из почвы микробы попадают в воду, воздух, на поверхность растений, других объектов внешней среды.
В почве содержатся многочисленные виды непатогенных бактерий, актиномицетов, грибов и простейших, а также некоторые болезнетворные микробы (например, палочка газовой гангрены, столбняка, сибирской язвы и др.).
Санитарно-бактериологический анализ почвы включает определение микробного числа и содержания санитарно-показательных микроорганизмов почвы.
Микробное число почвы — это общее количество микроорганизмов, содержащихся в 1 г почвы. Для его определения, пробы почвы, взятые в асептических условиях, измельчают, растирают и готовят десятикратные разведения (от 1:100 до 1:100 000). Посев выполняют либо в глубину питательного агара (1 мл соответствующего разведения вносят в стерильную чашку Петри и заливают 10 мл расплавленного и охлажденного до 450С МПА или сусло-агара), либо на поверхность питательного агара (0,1 мл соответствующего разведения суспензии распределяют шпателем по поверхности МПА или сусло-агара в чашке Петри). Чашки с сусло-агаром помещают в термостат при 240С (для выявления грибов), чашки с МПА при 370С (для выявления бактерий), инкубируют 48 ч, после чего подсчитывают количество выросших колоний для каждого разведения почвы, вычисляя затем средний показатель микробного числа почвы.
Для определения коли-индекса почвы используют элективные питательные среды, например, жидкую среду Кесслера, содержащую пептон и лактозу (сбраживается кишечной палочкой с образованием кислоты и газа), а также желчь и краситель генциановый фиолетовый, которые подавляют рост многих почвенных микроорганизмов, но не препятствуют росту кишечной палочки. Для улавливания газа, образовавшегося в результате расщепления лактозы, служат специальные стеклянные «поплавки». После суточной инкубации посевов почвы на среде Кесслера отбирают положительные пробы, характеризующие рост Е.coli в виде диффузного роста и образования газа, скапливающегося в «поплавке». Из этих проб делают высевы на среду Эндо, инкубируют их при 370С 24 ч, отмечая характерные для Е. coli темно-красные колонии с металлическим блеском, из которых готовят мазки и при наличии в них грамотрицательных палочек делают вывод о присутствии Е. coli.
Перфрингенс-титр почвы – наименьшее ее количество в граммах, в котором содержится одна жизнеспособная клетка Cl. perfringens, определяется на железо-сульфитном агаре (среда Вильсона — Блера). Посев почвы производят из дестикратных разведений почвенной суспензии, прогретых при 800 С 10—15 мин с целью инактивации вегетативных форм бактерий. Затем из соответствующих разведений берут стерильной пипеткой по 1 мл суспензии и вносят в пробирку с расплавленной средой Вильсона-Блера. Посев помещают в термостат при 37-430 С. При наличии в пробе Cl. perfringens через 3-18 часов образуется сульфид железа (FeS), окрашивающий колонии этого микроорганизма в черный цвет. При ферментации глюкозы образуются газы, разрывающие среду. Можно использовать также молочные среды, на которых Cl. perfringens энергично сбраживает лактозу, в результате этого молоко быстро (в течение 3—4 ч) створаживается в виде губчатого сгустка, а образующийся при этом газ разрывает сгустки казеина, вытесняя их в верхнюю часть пробирки. Наличие Cl. perfringens в средах подтверждается микроскопическим методом (в мазках, окрашенных по Граму, обнаруживают крупные грамположительные палочки с центрально расположенной спорой, которые могут располагаться цепочками).
Микрофлора воды. Вода открытых водоемов содержит различное количество микроорганизмов в зависимости от содержания в ней органических веществ, глубины залегания водоносного слоя и характера грунта. Загрязнение воды открытых водоемов происходит сточными водами и с поверхности почвы, содержащими большое количество различных микробов, включая кишечную палочку. В воду могут попадать болезнетворные микробы, в частности, возбудители кишечных инфекций (брюшного тифа и паратифов, дизентерии, холеры и др.).
Санитарно-бактериологический анализ воды проводится с целью определения микробного числа (общего количества мезофильных аэробных и факультативных анаэробных микроорганизмов) в 1 мл воды и содержания санитарно-показательных микроорганизмов.
Для определения микробного числа 1 мл воды вносят в 2 пустые стерильные чашки Петри, в которые наливают 10-12 мл расплавленного при температуре 450С МПА в одну чашку и такое же количество сусло-агара во вторую, перемешивают и после застывания сред культивируют на МПА при 370С 24 ч, а на сусло-агаре для выявления роста грибов 2—3 сут при температуре 240С. Учитывают число колоний микроорганизмов, что соответствует микробному числу воды, которое для питьевой воды централизованного водоснабжения не должно превышать 50 микробных клеток в 1 мл.
В аптеках этим методом определяют микробное число дистиллированной воды, которое должно равняться 10-15. Пробы дистиллированной воды, используемой для приготовления лекарственных средств (кроме лекарств для инъекций и глазных капель), в объеме 300 мл отбирают из бюретки, конец которой обжигают ватой, смоченной спиртом, помещают в стерильные бутылки, закрываемых затем ватными пробками и бумажными колпачками. Пробы дистиллированной воды, используемой для приготовления инъекционных растворов и глазных капель, отбирают в стерильные флаконы в количестве 15—20 см3 (мл) из емкостей, в которых проводится стерилизация.
Определение кишечных палочек в воде (коли-индекс) проводят с использованием 2 методов - двухэтапного бродильного и метода мембранных фильтров.
Анализ воды с помощью двухэтапного бродильного метода проводят в трех параллельных рядах, начиная с 10; 1 и 0,1 мл. Для объемов 10 мл используют флаконы по 100 мл лактозо-пептонной среды, все остальные объемы воды вносят в пробирки с 5 мл питательной среды. Водопроводная вода исследуется в трех объемах по 100 мл воды, трех - по 10 мл воды и трех - по 1 мл. Культивирование посевов производят при 380С в течение 24 ч. В случае отсутствия помутнения среды и образования газа через сутки дается отрицательный ответ. При наличии помутнения среды кислоты и газа из такого флакона производят посев на сектора чашки со средой Эндо. Если через 16-18 ч на среде вырастают темно-красные с металлическим блеском или колонии без блеска, из них готовят мазки и проводят пробу на оксидазу (снимают по 2-3 колонии и наносят на фильтровальную бумагу, смоченную диметил-пара-фенилендиамином; кишечная палочка оксидазой не обладает, поэтому изменения цвета фильтровальной бумаги не происходит). Наличие в мазках грамотрицательных палочек и отсутствие оксидазы свидетельствует о положительном результате исследований, которые выражают в виде коли-индекса (количество кишечных палочек в 1 л воды). Для питьевой воды централизованного водоснабжения коли-индекс не должен быть больше трех.
Для определения коли-индекса воды методом мембранных фильтров фильтруют воду в объеме от 300 до 500 мл, помещая затем фильтр на поверхность среды Эндо. Чашки с фильтрами инкубируют при 370С в течение 18-24 ч. Количество темно-красных колоний с металлическим блеском на фильтре, в которых при микроскопическом исследовании находят грамотрицательные палочки, соответствует коли-индексу при перерасчете показателя на 1 литр воды. Для водопроводной воды коли-индекс составляет 2.
Другим санитарно-показательным микроорганизмом, свидетельствующем о фекальном загрязнении воды, является энтерококк (Streptococcus faecalis). Индекс энтерококков в исследуемой воде определяют в параллельных рядах посевов в жидкой щелочно-полимиксиновой среде с 10-кратными разведениями в зависимости от предполагаемого бактериального загрязнения воды от 100 до 0,01 мл. Объемы воды по 100 и 10 мл вносят в щелочно-полимиксиновую среду двойной концентрации, остальные объемы — в пробирки со средой обычной концентрации, учет производят после 24 ч инкубации при 37 °С по изменению цвета и помутнению среды. Из этих флаконов проводят высев на сектора чашки с молочно-ингибиторной средой. Фекальный стрептококк растет на секторах чашек в виде черных колоний с металлическим блеском.
Микрофлора воздуха. Воздух не является благоприятной средой для обитания микробов, попадающих в него из почвы, воды, организма человека и животных, существуя в нем ограниченный промежуток времени. В воздухе найдены сапрофитные спорообразующие бактерии, стафилококки, сарцины, споры грибов, а также некоторые патогенные виды микробов, выделяемые человеком через верхние дыхательные пути при воздушно-капельных инфекциях (грипп, респираторные инфекции, коклюш, дифтерия и др.).
Санитарно-бактериологическое исследование воздуха. Включает определение микробного числа воздуха и санитарно-показательных микроорганизмов.
Микробное число воздуха определяется обычно аспирационным методом с помощью аппарата Кротова (рис.33, см. приложение) со скоростью просасывания воздуха не менее 25 л/мин. В аппарате Кротова воздух засасывается через щель, ударяясь о поверхность питательной среды в чашке Петри. В качестве питательной среды для определения микробного числа пользуются мясо-пептонным агаром, а для определения санитарно-показательных микроорганизмов применяются специальные питательные среды (для выявления золотистого стафилококка - молочно-солевой или желточно-солевой агар и для обнаружения стрептококков - среда Гарро). Преимуществом этого метода является возможность посева определенного объема воздуха. Для определения общего числа бактерий количество пропущенного воздуха составляет 100 л, для выявления санитарно-показательных микроорганизмов (золотистого стафилококка), дрожжевых и плесневых грибов - 250 л. Для определения роста сапрофитных бактерий используют МПА, грибов - сусло-агар и агар Сабуро, золотистого стафилококка — желточно-солевой агар. В каждом помещении аптеки посев делают на 5-10 чашек Петри с МПА и желточно-солевым агаром. Посевы помещают в термостат при 370С на 24 ч, после чего выдерживают 24 ч при комнатной температуре; посевы на среде Сабуро выращивают при 22—280С 4 сут. Затем подсчитывают количество выросших колоний и производят пересчет на 1 м3 воздуха. Идентификацию золотистого стафилококка, выросшего на желточно-солевом агаре проводят по общепринятым тестам. Допустимые нормы микробного числа воздуха различных помещений аптеки представлены в табл. 6.
В последнее время для определения микрофлоры воздуха разработаны более совершенные приборы – импакторы (рис. 34, см. приложение).
В качестве ориентировочного метода оценки микрофлоры воздуха может использоваться седиментационный метод.
Для этого чашки Петри с плотной питательной средой открывают в местах отбора проб воздуха, выдерживая в течение 5-30 мин, после чего чашки закрывают и помещают их в термостат. По количеству выросших колоний подсчитывают микробное число воздуха, пользуясь правилом Омелянского, в соответствии с которым считают, что на поверхность питательной среды площадью 100 см2 в течение 5 мин оседает столько микроорганизмов, сколько их содержится в 10 л воздуха. Каждая микробная клетка дает начало одной колонии. Зная количество выросших колоний и время экспозиции, вычисляют количество микробов, содержащихся в 1 м3 (1000 л) воздуха.
Результаты определения микробной загрязненности воздуха различных помещений аптек представлены в таблице 6.
Согласно действующим санитарным правилам, микробиологическое исследование воздуха различных помещений аптек осуществляется работниками центров санитарно-эпидемиологического надзора не реже одного раза в квартал.
Анализ микробной загрязненности столов, оборудования, аптечной посуды, полотенец, халатов, рук персонала. Санитарно-бактериологическому анализу подвергаются смывы со столов, оборудования, полотенец, халатов и рук работников аптек (1 раз в месяц); растворы для инъекций, глазные капли до стерилизации, нестерильные лекарственные формы; аптечная посуда и пробки на общую микробную обсемененность (2 раза в квартал). Эти исследования направлены на проверку качества мытья посуды, соблюдения правил санитарного режима и приготовления лекарственных препаратов. Кроме определения микробного числа, исследуют состав микрофлоры на наличие Е. coli, энтерококков, энтеровирусов, S. aureus, синегнойной палочки и бактерий рода Proteus, а при необходимости - патогенных микроорганизмов.
53. Микрофлора воздуха и методы его бактериологического исследования.
В воздух попадают микроорганизмы из дыхательных путей и с каплями слюны человека и животных. Здесь обнаруживаются кокковидные и палочковидные бактерии, бациллы, клостридии, актиномицеты, грибы и вирусы. С целью снижения микробной обсемененности воздуха проводят влажную уборку помещения, очистку поступающего воздуха. Применяют также аэрозольную дезинфекцию и обработку помещений лампами ультрафиолетового излучения.
Микробиологический контроль воздуха проводится с помощью методов естественной или принудительной седиментации микробов. Естественная седиментация (по методу Коха) проводится в течение 10 мин путем осаждения микробов на поверхность твердой питательной среды в чашке Петри. Принудительная седиментация микробов осуществляется путем «посева» проб воздуха на питательные среды с помощью специальных приборов.
Санитарно-гигиеническое состояние воздуха определяется по следующим микробиологическим показателям:
1. Общее количество микроорганизмов в 1 м воздуха (обсемененность воздуха) — количество колоний микроорганизмов, выросших при посеве воздуха на питательном агаре в чашке Петри в течение 24 ч при 37С.
2. Индекс санитарно-показательных микробов— количество золотистого стафилококка и гемолитических стрептококков в 1 м3 воздуха. Эти бактерии являются представителями микрофлоры верхних дыхательных путей и имеют общий путь выделения с патогенными микроорганизмами, передающимися воздушно-капельным путем. Появление в воздухе спорообразующих бактерий — показатель загрязненности воздуха микроорганизмами почвы, а появление грамотрицательных бактерий — показатель возможного антисанитарного состояния.
В воздух попадают микроорганизмы из дыхательных путей и с каплями слюны человека и животных. Здесь обнаруживаются кокковидные и палочковидные бактерии, бациллы, клостридии, актиномицеты, грибы и вирусы.
Золотистый стафилококк и гемолитические стрептококки являются представителями микрофлоры верхних дыхательных путей и имеют общий путь выделения с патогенными микроорганизмами, передающимися воздушно-капельным путем. Появление в воздухе спорообразующих бактерий — показатель загрязненности воздуха микроорганизмами почвы, а появление грамотрицательных бактерий — показатель возможного антисанитарного состояния.
По эпидемиологическим показаниям в воздухе определяют наличие сальмонелл, микобактерий, вирусов.
54. Микрофлора воды и методы ее бактериологического исследования.
Микрофлора воды отражает микробный состав почвы, так как микроорганизмы, в основном, попадают в воду с ее частичками. В воде формируются определенные биоценозы с преобладанием микроорганизмов, адаптировавшихся к условиям местонахождения, освещенности, степени растворимости кислорода и диоксида углерода, содержания органических и минеральных веществ.
В водах пресных водоемов обнаруживаются различные бактерии: палочковидные (псевдомонады, аэромонады), кокковидные (микрококки) и извитые. Загрязнение воды органическими веществами сопровождается увеличением анаэробных и аэробных бактерий, а также грибов. Микрофлора воды выполняет роль активного фактора в процессе самоочищения ее от органических отходов, которые утилизируются микроорганизмами. Вместе с сточными водами попадают представители нормальной микрофлоры человека и животных (кишечная палочка, цитробактер, энтеробактер, энтерококки, клостридии) и возбудители кишечных инфекций (брюшного тифа, паратифов, дизентерии, холеры, лептоспироза, энтеровирусных инфекций). Таким образом, вода является фактором передачи возбудителей многих инфекционных заболеваний. Некоторые возбудители могут даже размножаться в воде (холерный вибрион, легионеллы).
Микрофлора воды океанов и морей также содержит различные микроорганизмы, в том числе светящиеся и галофильные вибрионы,
поражающие рыб, при употреблении которых в пищу развивается пищевая токсикоинфекция.
Методы санитарно-бактериологического исследования воды.
В воде регистрируют кишечную палочку, БГКП (колиформные палочки), энтерококк, стафилококки. На основании количественного выявления этих санитарно-показательных бактерий вычисляются индекс БГКП (число БГКП в 1 л воды), титр энтерококка.
Общее микробное число— количество аэробных и факультативно-анаэробных бактерий в 1 мл воды — определяют у всех видов воды. Исследуемую воду вносят по 1 мл в две стерильные чашки Петри и заливают питательным агаром. Результат вычисляют путем суммирования среднего арифметического числа бактерий, дрожжевых и плесневых грибов.
Определение колиформных бактерий. Общие колиформные бактерии — это Гр- аспорогенные палочки, не обладающие оксидазной активностью и сбраживающие лактозу с образованием кислоты и газа. Их обнаружение свидетельствует о свежем фекальном загрязнении воды.
Определение колифагов. Присутствие колифагов (бактериофагов, паразитирующих на Е. coli) определяют в воде поверхностных источников и питьевой воде, в сточных водах. Исследование проводят методом агаровых слоев. При наличии колифагов образуются прозрачные бляшки.
Определение спор сульфитредуцирующих клостридий. Присутствие спор клостридий определяют в воде для оценки эффективности работы сооружений по подготовке питьевой воды. В результате прорастания спор, размножения клостридий и восстановления ими сульфита образуется сульфид железа, который придает среде черный цвет.
Общее микробное число— количество аэробных и факультативно-анаэробных бактерий в 1 мл воды — определяют у всех видов воды. Исследуемую воду вносят по 1 мл в две стерильные чашки Петри и заливают питательным агаром. Результат вычисляют путем суммирования среднего арифметического числа бактерий, дрожжевых и плесневых грибов.
ОМЧ не должно превышать 100 микробов в 1 мл. воды.
Коли – индекс – измеряется количеством БГКП, содержащихся в 1 л. исследуемой воды.
Определение колиформных бактерий. Общие колиформные бактерии — это Гр- аспорогенные палочки, не обладающие оксидазной активностью и сбраживающие лактозу с образованием кислоты и газа. Их обнаружение свидетельствует о свежем фекальном загрязнении воды.
Общие колиформные бактерии должны отсутствовать в 100 мл. воды.
Определение колифагов. Присутствие колифагов (бактериофагов, паразитирующих на Е. coli) определяют в воде поверхностных источников и питьевой воде, в сточных водах. Исследование проводят методом агаровых слоев. При наличии колифагов образуются прозрачные бляшки.
Колифаги не должны определяться в 100 мл. воды.
Для отбора проб используют стерильные флаконы емкостью 500 мл с пробкой. Предварительно проводят обжигание кранов пламенем горящего тампона, смоченного спиртом, и спускают воду в течение 10— 15 мин при полностью открытом кране. Бумажный колпачок с пробкой снимают с флакона непосредственно перед ее заполнением, не касаясь руками горлышка флакона и пробки.
Пробы воды очищенной, используемой для приготовления лекарственных форм отбирают в количестве 500 мл в стерильные бутылки, закрытые ватными пробками и бумажными колпачками. Пробы отбирают из бюретки, у которой предварительно обжигают кончик с помощью ватного тампона, смоченного спиртом.
Пробы воды очищенной для приготовления инъекционных растворов и глазных капель отбирают в стерильные флаконы в количестве 20 мл.
В воде регистрируют кишечную палочку, БГКП (колиформные палочки).
К бактериям группы кишечной палочки относят грамотрицательные палочки, сбраживающие с образованием кислоты и газа лактозу или глюкозу. Этот показатель применяют как индикатор фекального загрязнения воды. Колиформные бактерии, фекальные кишечные палочки – показатели свежего фекального загрязнения.
Определение колиформных бактерий. Общие колиформные бактерии — это Гр- аспорогенные палочки, не обладающие оксидазной активностью и сбраживающие лактозу с образованием кислоты и газа. Их обнаружение свидетельствует о свежем фекальном загрязнении воды.
Общие колиформные бактерии должны отсутствовать в 100 мл. воды.
55. Микрофлора почвы и методы ее бактериологического исследования.
Состав микрофлоры почвы зависит от ее типа и состояния, состава растительности, температуры, влажности. В почве живут азотфиксирующие бактерии, способные усваивать молекулярный азот (Azotobacter,, Mycobacterium.). Почва является местом обитания спорообразуюших палочек родов Bacillus и Closlridium. Патогенные спорообразующие палочки (возбудители сибирской язвы, ботулизма, столбняка, газовой гангрены) способны длительно сохраняться, а некоторые даже размножаться в почве (Clostridium botulinum).
Кишечные бактерии (сем. Enterobacteriaceae) — кишечная палочка, возбудители брюшного тифа, сальмонеллезов, дизентерии — могут попадать в почву с фекалиями. Обнаружение их в значительных количествах является показателем загрязнения почвы фекалиями человека и животных.
В почве находятся грибы, они участвуют в почвообразовании. Токсинообразующие грибы, попадая в продукты питания – вызывают интоксикацию.
Состав микрофлоры почвы зависит от ее типа и состояния, состава растительности, температуры, влажности. Большинство почвенных микроорганизмов способны развиваться при нейтральном рН, высокой относительной влажности, температуре от 25 до 40С.
Общее микробное число определяют глубинным посевом (на плотной среде) Перфрингенс-титр почвы - минимальное количество почвы, в котором еще определяются Clostridium perfringens. При фекальном загрязнении почвы клостридии обнаруживают в титре 0,01 г. Определяют перфрингенс-титр глубинным посевом.
Оценка фекального заражения проводится по индексу БГКП – коли-титр(количество БГКП в 1 г почвы).
На свежее фекальное загрязнение указывают: обнаружение энтерококков, большое количество БГКП при отсутствии нитрифицирующих бактерий, относительно высокое содержание вегетативных форм клостридий.
Титр БГКП и перфрингенс-титр для сильно загрязненных почв – 0,009; для чистых почв – коли-титр 1,0; перфрингенс-титр – 0,01.
56. Формы симбиоза у бактерий. Факторы симбиоза, определяющие адгезию, колонизацию, инвазию, токсичность и т.п. Характеристика патогенов, резидентов и гетеробионтов.
Микроорганизмы, обитающие во внешней среде, в организме человека или животных могут сожительствовать между собой (симбиоз). Формами симбиоза являются мутуализм (взаимовыгодный симбиоз), метабиоз (один микроорганизм использует для своих целей продукты жизнедеятельности другого микроорганизма), комменсализм (один микроорганизм извлекает для себя выгоду от другого, не причиняя ему вреда), сателлизм (усиление роста одного вида микроорганизма по влиянием другого).
Антагонистические взаимоотношения или антагоностический симбиоз выражается в виде неблагоприятных эффектов одних микроорганизмов на другие. Антагонизм проявляется в виде подавления роста бактерий (бактериостатические эффекты) или растворения, гибели бактерий (бактериолитические, бактерицидные эффекты), что может быть связано с прямым влиянием микробов друг на друга или неспецифическим действием антимикробных продуктов обмена бактерий (кислоты, щелочи, спирты, перекиси, сероводород, аммиак, антибиотики, бактериоцины и др.). Явление антагонизма широко применяется в практических целях для поиска и создания антибиотиков.
Среди нормальной микрофлоры выделяют резидентную и транзиторную микрофлору. Резидентная (постоянная) облигатная микрофлора представлена микроорганизмами, постоянно присутствующими в организме. Транзиторная (непостоянная) микрофлора не способна к длительному существованию в организме.
57. Нормальная микрофлора организма человека и ее значение.
Организм человека заселен (колонизирован) более чем 500 видов микроорганизмов, составляющих нормальную микрофлору человека, находящихся в состоянии равновесия (эубиоза) друг с другом и организмом человека. Микрофлора представляет собой стабильное сообщество микроорганизмов, т.е. микробиоценоз. Она колонизирует поверхность тела и полости, сообщающиеся с окружающей средой. Место обитания сообщества микроорганизмов называется биотопом. В норме микроорганизмы отсутствуют в легких и матке. Различают нормальную микрофлору кожи, слизистых оболочек рта, верхних дыхательных путей, пищеварительного тракта и мочеполовой системы. Среди нормальной микрофлоры выделяют резидентную и транзиторную микрофлору. Резидентная (постоянная) облигатная микрофлора представлена микроорганизмами, постоянно присутствующими в организме. Транзиторная (непостоянная) микрофлора не способна к длительному существованию в организме.
Микрофлора кожи имеет большое значение в распространении микроорганизмов в воздухе. На коже и в ее более глубоких слоях (волосяные мешочки, просветы сальных и потовых желез) анаэробов в 3—10 раз больше, чем аэробов. Кожу колонизируют пропионибактерии, коринеформные бактерии, стафилококки, стрептококки, дрожжи Pityrosporum, дрож-жеподобные грибы Candida, редко микрококки, Мус. fortuitum. На 1 см2 кожи приходится менее 80 000 микроорганизмов. В норме это количество не увеличивается в результате действия бактерицидных стерилизующих факторов кожи.
В верхние дыхательные пути попадают пылевые частицы, нагруженные микроорганизмами, большая часть которых задерживается в носо- и ротоглотке. Здесь растут бактероиды, коринеформные бактерии, гемофильные палочки, пептококки, лактобактерии, стафилококки, стрептококки, непатогенные нейссерии и др. Трахея и бронхи обычно стерильны.
Микрофлора пищеварительного тракта является наиболее представительной по своему качественному и количественному составу. При этом микроорганизмы свободно обитают в полости пищеварительного тракта, а также колонизируют слизистые оболочки.
В полости рта обитают актиномицеты, бактероиды, бифи-цобактерии, эубактерии, фузобактерии, лактобактерии, гемофильные палочки, лептотрихии, нейссерии, спирохеты, стрептококки, стафилококки, вейлонеллы и др. Обнаруживаются также грибы рода Candida и простейшие. Ассоцианты нормальной микрофлоры и продукты их жизнедеятельности образуют зубной налет.
Микрофлора желудка представлена лактобациллами и дрожжами, единичными грамотрицательными бактериями. Она несколько беднее, чем, например, кишечника, так как желудочный сок имеет низкое значение рН, неблагоприятное для жизни многих микроорганизмов. При гастритах, язвенной болезни желудка обнаруживаются изогнутые формы бактерий — Helicobacter pylori, которые являются этиологическими факторами патологического процесса.
В тонкой кишке микроорганизмов больше, чем в желудке; здесь обнаруживаются бифидобактерии, клостридии, эубактерии, лактобациллы, анаэробные кокки.
Наибольшее количество микроорганизмов накапливается в толстой кишке. В 1 г фекалий содержится до 250 млрд микробных клеток. Около 95 % всех видов микроорганизмов составляют анаэробы. Основными представителями микрофлоры толстой кишки являются: грамположительные анаэробные палочки (бифидобактерии, лактобациллы, эубактерии); грамположительные спорообразующие анаэробные палочки (клостридии, перфрингенс и др.); энтерококки; грамотрицательные анаэробные палочки (бактероиды); грамотрицательные факультативно-анаэробные палочки (кишечные палочки и сходные с ними бактерии.
Микрофлора толстой кишки — своеобразный экстракорпоральный орган. Она является антагонистом гнилостной микрофлоры, так как продуцирует молочную, уксусную кислоты, антибиотики и др. Известна ее роль в водно-солевом обмене, регуляции газового состава кишечника, обмене белков, углеводов, жирных кислот, холестерина и нуклеиновых кислот, а также продукции биологически активных соединений — антибиотиков, витаминов, токсинов и др. Морфокинетическая роль микрофлоры заключается в ее участии в развитии органов и систем организма; она принимает участие также в физиологическом воспалении слизистой оболочки и смене эпителия, переваривании и детокси-кации экзогенных субстратов и метаболитов, что сравнимо с функцией печени. Нормальная микрофлора выполняет, кроме того, антимутагенную роль, разрушая канцерогенные вещества.
Пристеночная микрофлора кишечника колонизирует слизистую оболочку в виде микроколоний, образуя своеобразную биологическую пленку, состоящую из микробных тел и экзополи-сахаридного матрикса. Экзополисахариды микроорганизмов, называемые гликокаликсом, защищают микробные клетки от разнообразных физико-химических и биологических воздействий. Слизистая оболочка кишечника также находится под защитой биологической пленки.
Важнейшей функцией нормальной микрофлоры кишечника является ее участие в колонизационной резистентности, под которой понимают совокупность защитных факторов организма и конкурентных, антагонистических и других особенностей анаэробов кишечника, придающих стабильность микрофлоре и предотвращающих колонизацию слизистых оболочек посторонними микроорганизмами.
Нормальная микрофлора влагалища включает бактероиды, лактобактерии, пептострептококки и клостридии.
Представители нормальной микрофлоры при снижении сопротивляемости организма могут вызвать гнойно-воспалительные процессы, т.е. нормальная микрофлора может стать источником аутоинфекции, или эндогенной инфекции. Она также является источником генов, например генов лекарственной устойчивости к антибиотикам.
58. Нарушения нормальной микрофлоры. Причины дисбиоза, его диагностика и лечение
Состояние эубиоза — динамического равновесия нормальной микрофлоры и организма человека — может нарушаться под влиянием факторов окружающей среды, стрессовых воздействий, широкого и бесконтрольного применения антимикробных препаратов, лучевой терапии и химиотерапии, нерационального питания, оперативных вмешательств и т. д. В результате нарушается колонизационная резистентность. Аномально размножившиеся транзиторные микроорганизмы продуцируют токсичные продукты метаболизма — индол, скатол, аммиак, сероводород.
Состояния, развивающиеся в результате утраты нормальных функций микрофлоры, называются дисбактериозом и дисбиозом.
При дисбактериозе происходят стойкие количественные и качественные изменения бактерий, входящих в состав нормальной микрофлоры. При дисбиозе изменения происходят и среди других групп микроорганизмов (вирусов, грибов и др.). Дисбиоз и дисбактериоз могут приводить к эндогенным инфекциями.
Дисбиозы классифицируют по этиологии (грибковый, стафилококковый, протейный и др.) и по локализации (дисбиоз рта, кишки, влагалища и т. д.). Изменения в составе и функциях нормальной микрофлоры сопровождаются различными нарушениями: развитием инфекций, диарей, запоров, синдрома мальабсорбции, гастритов, колитов, язвенной болезни, злокачественных новообразований, аллергий, мочекаменной болезни, гипо- и гиперхолестеринемии, гипо- и гипертензии, кариеса, артрита, поражений печени и др.
Нарушения нормальной микрофлоры человека определяются следующим образом:
1. Выявление видового и количественного состава представителей микробиоценоза определенного биотопа (кишки, рта, влагалища, кожи и т. д.) — путем высева из разведений исследуемого материала или путем отпечатков, смыва на соответствующие питательные среды (среда Блаурокка — для бифидобактерий; среда МРС-2 — для лактобактерий; анаэробный кровяной агар — для бактероидов; среда Левина или Эндо — для энтеробактерий; желчно-кровяной агар — для энтерококков; кровяной агар — для стрептококков и гемофилов; мясопептонный агар с фурагином — для синегнойной палочки, среда Сабуро — для грибов и др.).
2. Определение в исследуемом материале микробных метаболитов — маркеров дисбио-за (жирных кислот, гидроксижирных кислот, жирнокислотных альдегидов, ферментов и др.). Например, обнаружение в фекалиях бета-аспартил-глицина и бета-аспартиллизина свидетельствует о нарушении кишечного микробиоценоза, так как в норме эти дипеп-тиды метаболизируются кишечной анаэробной микрофлорой.
Для восстановления нормальной микрофлоры: а) проводят селективную деконтами-нацию; б) назначают препараты пробиотиков (эубиотиков), полученные из лиофильно высушенных живых бактерий — представителей нормальной микрофлоры кишечника — бифидобактерий (бифидумбактерин), кишечной палочки (колибактерин), лактобактерий (лактобактерин) и др.
Пробиотики — препараты, оказывающие при приеме per os нормализирующее действие на организм человека и его микрофлору.
59. Учение о биоплёнках. Биоплёнки и механизмы их образования. Адгезия и коаггрегация бактерий. Понятие о кворум-сенсинге бактерий и его факторах.
На слизистых оболочках, особенно желудочно- кишечного тракта, представители нормальной микрофлоры обитают в виде двух форм- часть из них располагается в просвете (просветная), другая заключена в мукозный пристеночный матрикс, образующий биопленку (пристеночная микрофлора).
К факторам патогенности относят способность микроорганизмов прикрепляться к клеткам (адгезия), размещаться на их поверхности (колонизация), проникать в клетки (инвазия) и противостоять факторам защиты организма (агрессия).
Адгезия является пусковым механизмом инфекционного процесса. Под адгезией понимают способность микроорганизма адсорбироваться на чувствительных клетках с последующей колонизацией. Структуры, ответственные за связывание микроорганизма с клеткой называются адгезинами и располагаются они на его поверхности. Адгезины очень разнообразны по строению и обусловливают высокую специфичность - способность одних микроорганизмов прикрепляться к клеткам эпителия дыхательных путей, других - кишечного тракта или мочеполовой системы и т.д. На процесс адгезии могут влиять физико-химические механизмы, связанные с гидрофобностью микробных клеток, суммой энергии притяжения и отталкивания. У грамотрицательных бактерий адгезия происходит за счет пилей I и общего типов. У грамположительных бактерий адгезины представляют собой белки и тейхоевые кислоты клеточной стенки. У других микроорганизмов эту функцию выполняют различные структуры клеточной системы: поверхностные белки, липополисахариды,
Понятие «ощущение кворума» (Quorum Sensing) было предложено в 1994 году. Оно означает восприятие клетками изменений среды, которые наступают при достижении бактериальной культурой некоторой пороговой численности, и реакцию на эти изменения.
К числу описанных процессов, протекающих лишь при достаточно высокой плотности популяции, относятся следующие явления:
биолюминесценция у морских бактерий Vibrio fisheri и V.harveyi;
агрегация клеток миксобактерий и последующее формирование плодовых тел со спорами;
споруляция у бацилл и актиномицетов;
стимуляция роста у стрептококков и ряда других микроорганизмов;
конъюгация с переносом плазмид у Enterococcus faecalis и родственных видов, а также у бактерий рода Agrobacterium;
синтез экзоферментов и других факторов вирулентности у патогенов растений (Erwinia carotovora, E.hyacinthii и др.) и животных (Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus);
образование антибиотиков у представителей рода Streptomyces и у E.carotovora;
формирование биоплёнок у Р.aeruginosa и других микроорганизмов.
Раскрыты механизмы многих из указанных процессов, определены факторы межклеточной коммуникации, отвечающие за процессы, зависящие от плотности популяции.
Серьёзной проблемой клинической практики является широкое распространение устойчивых форм микроорганизмов, снижающее эффективность применения антибактериальных препаратов. Особенную трудность представляет повышенная лекарственная устойчивость бактерий в биоплёнках. Для синтеза факторов вирулентности, антибиотиков и формирования биоплёнок бактерии часто используют реакции кворум-сенсинга. Поэтому изучение механизмов таких реакций открывает новые возможности для предупреждения и лечения болезней, вызванных микробными агентами, а также позволяет по-иному взглянуть на сложный комплекс межвидовых бактериальных взаимодействий в природных местах обитания микроорганизмов.
60. Этапы симбиоза микробов с макроорганизмов.
Симбиоз – это взаимосвязанный метаболизм различных систем. Возникает между бактериями и макроорганизмами. Этапы симбиоза:
1 – Инфективность – микроб попадает в экологическую нишу, происходит адгезия и при благоприятных условиях колонизируется. Микроб прикрепляется за счет капсулы, пилей, лектиноподобных структур клеточной стенки, ферментов с помощью которых образуются липкие полимеры. Микроб находится
под контролем макроорганизма. 2 – Инвазивность (проникновение) – микроб выходит из под контроля макроорганизма и с помощью ферментов, которые разрушают ткани макроорганизма, проникает в глубь тканей. 3 – Токсичность – нанесение вреда токсинами. Микроб может выделять экзотоксин (при жизнедеятельности) и эндотоксин (липид А – липополисахарид клеточной стенки; вырабатывается после гибели бактриальной клетки). Токсинемия – всасывание токсина в кровь.
61. Понятие об инфекции. Роль микроба в инфекционном процессе. Особенности инфекционного процесса у детей разного возраста.
Термин инфекция или синоним инфекционный процесс обозначает совокупность физиологических и патологических восстановительно-приспособительных реакций, возникающих в восприимчивом макроорганизме при определенных условиях окружающей внешней среды в результате его взаимодействия с проникшими и размножающимися в нем патогенными или условно-патогенными бактериями, грибами и вирусами и направленных на поддержание постоянства внутренней среды макроорганизма (гомеостаза). Сходный процесс, но вызванный простейшими, гельминтами и насекомыми — представителями царства Animalia, носит название инвазия.
В основе инфекционного процесса лежит феномен паразитизма, т. е. такой формы взаимоотношений между двумя организмами разных видов, при которой один из них, называемый паразитом, использует другого, называемого хозяином, в качестве источника питания и как место постоянного или временного обитания, причем оба организма находятся между собой в антагонистических отношениях. В отличие от сапрофитического образа существования паразитизм — это жизнь в живой среде. Неотъемлемым критерием паразитизма является патогенное воздействие паразита на организм хозяина и ответная, защитная реакция со стороны организма хозяина. Паразитизм — свойство, закрепленное за видом и передающееся по наследству. Все возбудители инфекционных и инвазионных болезней человека, животных и растений относятся к паразитам, т. е. способны к паразитической форме существования в живой системе.
Возникновение, течение и исход инфекционного процесса определяются тремя группами факторов: 1) количественные и качественные характеристики микроба — возбудителя инфекционного процесса; 2) состояние макроорганизма, степень его восприимчивости к микробу; 3) действие физических, химических и биологических факторов окружающей микроб и макроорганизм внешней среды, которая и обуславливает возможность установления контактов между представителями разных видов, общность территории обитания разных видов, пищевые связи, плотность и численность популяций, особенности передачи генетической информации, особенности миграции и т. д. При этом по отношению к человеку под условиями внешней среды прежде всего следует понимать социальные условия его жизнедеятельности. Первые два биологических фактора являются непосредственными участниками инфекционного процесса, развивающегося в макроорганизме под действием микроба. При этом микроб определяет специфичность инфекционного процесса, а решающий интегральный вклад в форму проявления инфекционного процесса, его длительность, степень тяжести проявлений и исход вносит состояние макроорганизма, прежде всего факторы его неспецифической резистентности, на помощь которым приходят факторы специфического приобретенного иммунитета. Третий, экологический, фактор оказывает на инфекционный процесс опосредованное воздействие, снижая или повышая восприимчивость макроорганизма, либо снижая и повышая инфицирующую дозу и вирулентность возбудителя, активируя механизмы заражения и соответствующие им пути передачи инфекции, и т. д.
62. Понятие о патогенности и вирулентности. Характеристика факторов вирулентности микробов. Сравнительная характеристика экзо- и эндотоксинов бактерий.
Патогенность — видовой признак, передающийся по наследству, закрепленный в геноме микроорганизма, в процессе эволюции паразита, т. е. это генотипи-ческий признак, отражающий потенциальную возможность микроорганизма проникать в макроорганизм (инфективность) и размножаться в нем (инвазионность), вызывать комплекс патологических процессов, возникающих при заболевании.
Фенотипическим признаком патогенного микроорганизма является его вирулентность, т.е. свойство штамма, которое проявляется в определенных условиях (при изменчивости микроорганизмов, изменении восприимчивости макроорганизма и т.д.). Вирулентность можно повышать, понижать, измерять, т.е. она является мерой патогенности. Количественные показатели вирулентности могут быть выражены в DLM (минимальная летальная доза), DL« (доза, вызывающая гибель 50 % экспериментальных животных). При этом учитывают вид животных, пол, массу тела, способ заражения, срок гибели.
К факторам патогенности относят способность микроорганизмов прикрепляться к клеткам (адгезия), размещаться на их поверхности (колонизация), проникать в клетки (инвазия) и противостоять факторам защиты организма (агрессия).
Адгезия является пусковым механизмом инфекционного процесса. Под адгезией понимают способность микроорганизма адсорбироваться на чувствительных клетках с последующей колонизацией. Структуры, ответственные за связывание микроорганизма с клеткой называются адгезинами и располагаются они на его поверхности. Адгезины очень разнообразны по строению и обусловливают высокую специфичность - способность одних микроорганизмов прикрепляться к клеткам эпителия дыхательных путей, других - кишечного тракта или мочеполовой системы и т.д. На процесс адгезии могут влиять физико-химические механизмы, связанные с гидрофобностью микробных клеток, суммой энергии притяжения и отталкивания. У грамотрицательных бактерий адгезия происходит за счет пилей I и общего типов. У грамположительных бактерий адгезины представляют собой белки и тейхоевые кислоты клеточной стенки. У других микроорганизмов эту функцию выполняют различные структуры клеточной системы: поверхностные белки, липополисахариды, и др.
Инвазия. Под инвазивностью понимают способность микробов проникать через слизистые, кожу, соединительно-тканные барьеры во внутреннюю среду организма и распространятся по его тканям и органам. Проникновение микроорганизма в клетку связывается с продукцией ферментов, а также с факторами подавляющими клеточную защиту. Так фермент гиалуронидаза расщепляет гиалуроновую кислоту, входящую в состав межклеточного вещества, и, таким образом, повышает проницаемость слизистых оболочек и соединительной ткани. Нейраминидаза расщепляет нейраминовую кислоту, которая входит в состав поверхностных рецепторов клеток слизистых оболочек, что способствует проникновению возбудителя в ткани.
Агрессия. Под агрессивностью понимают способность возбудителя противостоять защитным факторам макроорганизма. К факторам агрессии относятся: протеазы - ферменты, разрушающие иммуноглобулины; коагулаза - фермент, свертывающий плазму крови; фибринолизин - растворяющий сгусток фибрина; лецитиназа - фермент, действующий на фосфолипиды мембран мышечных волокон, эритроцитов и других клеток. Патогенность может быть связана и с другими ферментами микроорганизмов, при этом они действуют как местно, так и генерализовано.
Важную роль в развитии инфекционного процесса играют токсины. По биологическим свойствам бактериальные токсины делятся на экзотоксины и эндотоксины.
Экзотоксины продуцируют как грамположительные, так и грамотрицательные бактерии. По своей химической структуре это белки. По механизму действия экзотоксина на клетку различают несколько типов: цитотоксины, мембранотоксины, функциональные блокаторы, эксфолианты и эритрогемины. Механизм действия белковых токсинов сводится к повреждению жизненно важных процессов в клетке: повышение проницаемости мембран, блокады синтеза белка и других биохимических процессов в клетке или нарушении взаимодействия и взаимокоординации между клетками. Экзотоксины являются сильными антигенами, которые и продуцируют образование в организме антитоксинов.
Экзотоксины обладают высокой токсичностью. Под воздействием формалина и температуры экзотоксины утрачивают свою токсичность, но сохраняют иммуногенное свойство. Такие токсины получили название анатоксины и применяются для профилактики заболевания столбняка, гангрены, ботулизма, дифтерии, а также используются в виде антигенов для иммунизации животных с целью получения анатоксических сывороток.
Эндотоксины по своей химической структуре являются липополисахаридами, которые содержатся в клеточной стенке грамотрицательных бактерий и выделяются в окружающую среду при лизисе бактерий. Эндотоксины не обладают специфичностью, термостабильны, менее токсичны, обладают слабой иммуногенностью. При поступлении в организм больших доз эндотоксины угнетают фагоцитоз, гранулоцитоз, моноцитоз, увеличивают проницаемость капилляров, оказывают разрушающее действие на клетки. Микробные липополисахариды разрушают лейкоциты крови, вызывают дегрануляцию тучных клеток с выделением вазодилататоров, активируют фактор Хагемана, что приводит к лейкопении, гипертермии, гипотонии, ацидозу, дессиминированной внутрисосудистой коагуляции (ДВК).
Эндотоксины стимулируют синтез интерферонов, активируют систему комплемента по классическому пути, обладают аллергическими свойствами.
При введении небольших доз эндотоксина повышается резистентность организма, усиливается фагоцитоз, стимулируются В-лимфоциты. Сыворотка животного иммунизированного эндотоксином обладает слабой антитоксической активностью и не нейтрализует эндотоксин.
Патогенность бактерий контролируется тремя типами генов: гены - собственной хромосомами, гены привнесенные плазмидами умеренными фагами.
63. Токсины бактерий и их характеристика.
Важную роль в развитии инфекционного процесса играют токсины. По биологическим свойствам бактериальные токсины делятся на экзотоксины и эндотоксины.
Экзотоксины продуцируют как грамположительные, так и грамотрицательные бактерии. По своей химической структуре это белки. По механизму действия экзотоксина на клетку различают несколько типов: цитотоксины, мембранотоксины, функциональные блокаторы, эксфолианты и эритрогемины. Механизм действия белковых токсинов сводится к повреждению жизненно важных процессов в клетке: повышение проницаемости мембран, блокады синтеза белка и других биохимических процессов в клетке или нарушении взаимодействия и взаимокоординации между клетками. Экзотоксины являются сильными антигенами, которые и продуцируют образование в организме антитоксинов.
По молекулярной организации экзотоксины делятся на две группы:
• экзотоксины состоящие из двух фрагментов;
• экзотоксины, составляющие единую полипептидную цепь.
По степени связи с бактериальной клетки экзотоксины делятся условно на три класса.
• Класс А - токсины, секретируемые во внешнюю среду;
• Класс В - токсины частично секретируемые и частично связанные с микробной клеткой;
• Класс С - токсины, связанные и с микробной клеткой и попадающие в окружающую среду при разрушении клетки.
Экзотоксины обладают высокой токсичностью. Под воздействием формалина и температуры экзотоксины утрачивают свою токсичность, но сохраняют иммуногенное свойство. Такие токсины получили название анатоксины и применяются для профилактики заболевания столбняка, гангрены, ботулизма, дифтерии, а также используются в виде антигенов для иммунизации животных с целью получения анатоксических сывороток.
Эндотоксины по своей химической структуре являются липополисахаридами, которые содержатся в клеточной стенке грамотрицательных бактерий и выделяются в окружающую среду при лизисе бактерий. Эндотоксины не обладают специфичностью, термостабильны, менее токсичны, обладают слабой иммуногенностью. При поступлении в организм больших доз эндотоксины угнетают фагоцитоз, гранулоцитоз, моноцитоз, увеличивают проницаемость капилляров, оказывают разрушающее действие на клетки. Микробные липополисахариды разрушают лейкоциты крови, вызывают дегрануляцию тучных клеток с выделением вазодилататоров, активируют фактор Хагемана, что приводит к лейкопении, гипертермии, гипотонии, ацидозу, дессиминированной внутрисосудистой коагуляции (ДВК).
Эндотоксины стимулируют синтез интерферонов, активируют систему комплемента по классическому пути, обладают аллергическими свойствами.
При введении небольших доз эндотоксина повышается резистентность организма, усиливается фагоцитоз, стимулируются В-лимфоциты. Сыворотка животного иммунизированного эндотоксином обладает слабой антитоксической активностью и не нейтрализует эндотоксин.
Патогенность бактерий контролируется тремя типами генов: гены - собственной хромосомами, гены привнесенные плазмидами умеренными фагами.
64. Генетическая регуляция факторов патогенности. Понятие об островках патогенности и кворум –сенсинге.
Как уже отмечалось, вирулентность обусловлена разными
факторами, которые проявляются в адгезии, колонизации, пенетра-
ции, инвазии и подавлении неспецифической и иммунной защиты
организма хозяина.
Все упомянутые признаки находятся под контролем хромосомных
и плазмидных генов. Так, образование пилей общего типа, участвующих
в а д г е з и и , контролируется хромосомными генами. В то же
нремя адгезия, колонизация и некоторые антигены у эшерихий контролируются
плазмидами CFA/I, CFA/II, CFA/III.
Образование биологически активных веществ, участвующих в
п е н е т р а ц и и , также контролируется плазмидами (например,
у шигелл Зонне и других бактерий), а ферментов гиалуронидазы и
нейраминидазы, участвующих в инвазии, — хромосомными генами.
(Синтез антифагоцитарных и антикомплементарных веществ, например
протеина А золотистого стафилококка, М-протеина пиогенно-
ю стрептококка, капсульного полисахарида пневмококка, контролируют
главным образом хромосомные гены. В R-плазмидах бактерий
содержатся транспозоны, контролирующие не только
множественную устойчивость к разным антибиотикам, но и их токсичность.
Трансмиссивность плазмид приводит к распространению
упомянутых признаков среди бактериальных клеток собственной и
соседних популяций. Генетический контроль токсинообразования
осуществляется хромосомными генами или разнообразными плазмидами:
F, R, Col и др., содержащими гох-транспозоны, а также
конвертирующими бактериофагами.
Хромосомные fox-гены контролируют образование холерогена,
эксфолиатина золотистого стафилококка, энтеротоксина Clostridium
perfringens и др. В составе хромосомы лизогенных культур, несущих
профаг, обнаружены /ox-гены, контролирующие образование дифтерийного
гистотоксина, скарлатинозного эритрогенного токсина, боту-
линического нейротоксина.
В некоторых плазмидах, находящихся в автономном, независимом
от хромосомы состоянии, содержатся /ox-гены, ответственные за образование
термолабильного энтеротоксина кишечной палочки и других
токсинов. Многие /ox-плазмиды контролируют образование не
самих токсинов, а протоксинов, требующих для своей активации дополнительного
компонента. Этим активирующим компонентом являются
протеазы, образование которых находится под контролем хромосомных
генов. Протеазы участвуют в активации многих протоксинов,
например дифтерийного гистотоксина, ботулинического
нейротоксина и др. Таким образом, осуществляется совместный контроль
плазмидными и хромосомными генами за образованием функционально
активных токсинов.
Вирулентность и токсинообразование — непременные атрибуты
патогенности — можно рассматривать как проявление с е л е к т
и в н ы х преимуществ бактериальных клеток в организме хозяина.
Плазмиды, обеспечивающие распространение соответствующих
признаков среди клеток бактериальной популяции, способствуют
ее выживаемости in vivo. Это свидетельствует о том, что генетическая
информация, содержащаяся в плазмидах и транспозонах,
важна для клеток популяции только в данных конкретных условиях
ее существования. Изменение этих условий, например при попадании
бактерий из организма больного в окружающую среду или
невосприимчивый организм, лишает их данных преимуществ, что
может отразиться на выживаемости популяции в целом в новых
условиях существования.
Изменчивость вирулентности, так же как любого другого признака,
может носить ф е н о т и п и ч е с к и й и г е н о т и п
и ч е с к и й характер.
В первом случае ослабление вирулентности является нестойким
явлением, которое может быть связано in vitro с неблагоприятными
условиями культивирования бактерий или составом питательных сред.
Ослабление вирулентности происходит при обработке бактериальной
популяции гомологичной иммунной сывороткой. Однако в условиях
организма механизм действия может быть связан не с изменением
вирулентности бактерий, а с селекцией устойчивых маловирулентных
клеток, предсуществующих в гетерогенной бактериальной
популяции. При последующем культивировании восстановления вирулентности
полученной бактериальной культуры может не произой ги, если все вирулентные особи были нейтрализованы гомологичной
пнтисывороткой.
Аналогичным образом происходит селекция авирулентных мутантов
при воздействии на бактериальную популяцию соответствующих
селективных факторов. Так, например, авирулентный штамм БЦЖ был
селекционирован при многократных пересевах в течение многих лет
иирулентной культуры микобактерий туберкулеза на картофельно-глицериновой
среде с бычьей желчью.
Методы ослабления вирулентности патогенных микроорганизмов
имеют большое практическое значение для получения вакцинных
штаммов, т.е. таких авирулентных микробных культур, из которых
получают живые вакцины для специфической профилактики инфекционных
заболеваний.
Повышение вирулентности достигается путем культивирования
бактерий in vitro в оптимальных условиях или при многократных
пассажах маловирулентной культуры через организм чувствительного
лабораторного животного. В данном случае также имеет место
селекция вирулентных особей, содержащихся в гетерогенной бактериальной
популяции, что в конечном итоге может привести к повышению
ее вирулентности.
Генотипические изменения патогенных микроорганизмов имеют
место при мутациях, рекомбинациях, а также миграции внехромосом-
ных факторов наследственности (Is-элементы, транспозоны, плазмиды),
контролирующих вирулентность и токсинообразование.
65. Роль реактивности макроорганизма в инфекционном процессе.
Реактивность – свойство организма или его частей определенным образом реагировать на действие различных раздражителей. Это одно из основных, фундаментальных свойств живого. От реактивности в очень большей степени зависит приспособляемость организма к условиям среды, следовательно его успойчивость к действию патогенных факторов.
В основе реактивности организма, его систем и органов лежит реактивность клеток. На поверхности клетки существует высокореактивная микросреда – глипокаликс.
66. Роль внешней среды в развитии инфекции.
67. Роль социально-экономических факторов в развитии инфекции.
68. Пути распространения микробов в макроорганизме.
69. Пути передачи инфекционных заболеваний.
70. Характеристика заразного заболевания.
71. Формы инфекции.
В зависимости от свойств возбудителя, условий заражения, иммунологических особенностей макроорганизма формируются различные формы инфекционного процесса, который может протекать в виде носительства, латентной инфекции и инфекционной болезни.
При носительстве возбудитель размножается, циркулирует в организме, происходит формирование иммунитета и очищение организма от возбудителя, но отсутствуют субъективные и клинически выявляемые симптомы болезни (нарушение самочувствия, лихорадка, интоксикация, признаки органной патологии). Такое течение инфекционного процесса характерно для ряда вирусных и бактериальных инфекций (вирусного гепатита А, полиомиелита, менингококковой инфекции и некоторых других). О подобном течении инфекционного процесса можно судить по наличию специфических антител у лиц, не имевших клинических проявлений данной инфекционной болезни и не иммунизированных против нее.
В соответствии с носительством конкретных типов возбудителей применяют термины «бактерионосительство» («бациллоносительство»), «вирусоносительство», «гельминтоносительство». Термин «паразитоносительство» обозначает носительство патогенных паразитов вообще или носительство простейших.
Различают следующие виды носительства: реконвалесцентное, иммунное, «здоровое», инкубационное, транзиторное.
При латентной инфекции инфекционный процесс также длительно не проявляет себя клинически, но возбудитель сохраняется в организме, иммунитет не формируется и на определенном этапе при достаточно длительном сроке наблюдения возможно появление клинических признаков болезни. Такое течение инфекционного процесса наблюдается при туберкулезе, сифилисе, герпетической инфекции, цитомегаловирусной инфекции и др.
Перенесенная в той или иной форме инфекции не всегда гарантирует от повторного заражения, особенно при генетической предрасположенности, обусловленной дефектами в системе специфических и неспецифических защитных механизмов, или кратковременности иммунитета. Повторное заражение и развитие инфекции, вызванной тем же возбудителем, обычно в форме клинически выраженной инфекционной болезни (например, при менингококковой инфекции, скарлатине, дизентерии, роже, называются реинфекцией. Одновременное возникновение двух инфекционных процессов называется микст-инфекцией. Возникновение инфекционного процесса, вызванного активацией нормальной флоры, населяющей кожу и слизистые оболочки, обозначается как аутоинфекция. Последняя развивается, как правило, в результате резкого ослабления защитных механизмов, в частности приобретенного иммунодефицита. Например в результате тяжелых оперативных вмешательств, соматических заболеваний, применения стероидных гормонов, антибиотиков широкого спектра действия с развитие дисбактериоза, лучевых поражений и др. Возможно также на фоне инфекции, вызванной одним возбудителем; заражение и развитие инфекционного процесса, вызванного другим видом возбудителя; в этих случаях говорят о суперинфекции.
Для изучения патогенеза инфекции, разработки методов ее диагностики, лечения и профилактики широко используют экспериментальную инфекцию, т. е. воспроизведение инфекции на лабораторных животных. Несмотря на большое значение экспериментальной инфекции, полученные результаты применительно к человеку нуждаются в подтверждении в клинических условиях.
72. Иммунитет, его виды.
Иммунитет – это способ защиты организма от генетически чужеродных веществ – антигенов экзогенного и эндогенного происхождения, направленный на поддержание и сохранение гомеостаза, структурной и функциональной целостности организма, биологической (антигенной)индивидуальности каждого организма и вида в целом.
Различают несколько основных видов иммунитета.
Врожденный, иди видовой, иммунитет, он же наследственный, генетический, конституциональный — это выработанная в процессе филогенеза генетически закрепленная, передающаяся по наследству невосприимчивость данного вида и его индивидов к какому-либо антигену (или микроорганизму), обусловленная биологическими особенностями самого организма, свойствами данного антигена, а также особенностями их взаимодействия.
Примером может служить невосприимчивость человека к некоторым возбудителям, в том числе к особо опасным для сельскохозяйственных животных (чума крупного рогатого скота, болезнь Ньюкасла, поражающая птиц, оспа лошадей и др.), нечувствительность человека к бактериофагам, поражающим клетки бактерий. К генетическому иммунитету можно также отнести отсутствие взаимных иммунных реакций на тканевые антигены у однояйцовых близнецов; различают чувствительность к одним и тем же антигенам у различных линий животных, т. е. животных с различным генотипом.
Видовой иммунитет может быть абсолютным и относительным. Например, нечувствительные к столбнячному токсину лягушки могут реагировать на его введение, если повысить температуру их тела. Белые мыши, не чувствительные к какому-либо антигену, приобретают способность реагировать на него, если воздействовать на них иммунодепрессантами или удалить у них центральный орган иммунитета — тимус.
Приобретенный иммунитет — это невосприимчивость к антигену чувствительного к нему организма человека, животных и пр., приобретаемая в процессе онтогенеза в результате естественной встречи с этим антигеном организма, например, при вакцинации.
Примером естественного приобретенного иммунитета у человека может служить невосприимчивость к инфекции, возникающая после перенесенного заболевания, так называемый постинфекционный иммунитет (например, после брюшного тифа, дифтерии и других инфекций), а также «проиммуниция», т. е. приобретение невосприимчивости к ряду микроорганизмов, обитающих в окружающей среде и в организме человека и постепенно воздействующих на иммунную систему своими антигенами.
В отличие от приобретенного иммунитета в результате перенесенного инфекционного заболевания или «скрытной» иммунизации, на практике широко используют преднамеренную иммунизацию антигенами для создания к ним невосприимчивости организма. С этой целью применяют вакцинацию, а также введение специфических иммуноглобулинов, сывороточных препаратов или иммунокомпетентных клеток. Приобретаемый при этом иммунитет называют поствакцинальным, и служит он для защиты от возбудителей инфекционных болезней, а также других чужеродных антигенов.
Приобретенный иммунитет может быть активным и пассивным. Активный иммунитет обусловлен активной реакцией, активным вовлечением в процесс иммунной системы при встрече с данным антигеном (например, поствакцинальный, постинфекционный иммунитет), а пассивный иммунитет формируется за счет введения в организм уже готовых иммунореагентов, способных обеспечить защиту от антигена. К таким иммунореагентам относятся антитела, т. е. специфические иммуноглобулины и иммунные сыворотки, а также иммунные лимфоциты. Иммуноглобулины широко используют для пассивной иммунизации, а также для специфического лечения при многих инфекциях (дифтерия, ботулизм, бешенство, корь и др.). Пассивный иммунитет у новорожденных детей создается иммуноглобулинами при плацентарной внутриутробной передаче антител от матери ребенку ииграет существенную роль в защите от многих детских инфекций в первые месяцы жизни ребенка.
Поскольку в формировании иммунитета принимают участие клетки иммунной системы и гуморальные факторы, принято активный иммунитет дифференцировать в зависимости от того, какой из компонентов иммунных реакций играет ведущую роль в формировании защиты от антигена. В связи с этим различают клеточный, гуморальный, клеточно-гуморальный и гуморально-клеточ-ный иммунитет.
Примером клеточного иммунитета может служить противоопухолевый, а также трансплантационный иммунитет, когда ведущую роль в иммунитете играют цитотоксические Т-лимфоциты-киллеры; иммунитет при ток-синемических инфекциях (столбняк, ботулизм, дифтерия) обусловлен в основном антителами (антитоксинами); при туберкулезе ведущую роль играют иммунокомпетентные клетки (лимфоциты, фагоциты) с участием специфических антител; при некоторых вирусных инфекциях (натуральная оспа, корь и др.) роль в защите играют специфические антитела, а также клетки иммунной системы.
В инфекционной и неинфекционной патологии и иммунологии для уточнения характера иммунитета в зависимости от природы и свойств антигена пользуются также такой терминологией: антитоксический, противовирусный, противогрибковый, противобактериальный, противопротозойный, трансплантационный, противоопухолевый и другие виды иммунитета.
Наконец, иммунное состояние, т. е. активный иммунитет, может поддерживаться, сохраняться либо в отсутствие, либо только в присутствии антигена в организме. В первом случае антиген играет роль пускового фактора, а иммунитет называют стерильным. Во втором случае иммунитет трактуют как нестерильный. Примером стерильного иммунитета является поствакцинальный иммунитет при введении убитых вакцин, а нестерильного— иммунитет при туберкулезе, который сохраняется только в присутствии в организме микобактерий туберкулеза.
Иммунитет (резистентность к антигену) может быть системным, т. е. генерализованным, и местным, при котором наблюдается более выраженная резистентность отдельных органов и тканей, например слизистых верхних дыхательных путей (поэтому иногда его называют мукозальным).
После работ Л. Пастера появилось множество исследований, в которых пытались объяснить причины и механизмы формирования иммунитета после вакцинации. Выдающуюся роль в этом сыграли работы И. И. Мечникова и П. Эрлиха.
Исследования И. И. Мечникова (1845—1916) показали, что большую роль в формировании иммунитета играют особые клетки — макро- и микрофаги. Эти клетки поглощают и переваривают чужеродные частицы, в том числе бактерии. Исследования И. И. Мечникова по фагоцитозу убедительно доказали, что, помимо гуморального, существует клеточный иммунитет. И. И. Мечников, ближайший помощник и последователь Л. Пастера, заслуженно считается одним из основоположников иммунологии. Его работы положили начало изучению иммунокомпетентных клеток как морфологической основы иммунной системы, ее единства и биологической сущности.
Д.И.Ивановский (1864— 1920) открыл вирусы — представителей царства vira. Один из основоположников вирусологии. Впервые открыл проходящий через бактериологические фильтры возбудитель табачной мозаики, названный впоследствии вирусом. Труды по фитопатологии и физиологии растений.
Гамалея - выдающийся микробиолог. Вместе с И. И. Мечниковым в 1886 году организовал в Одессе первую в России бактериологическую станцию. Автор многих работ по микробиологии и иммунологии (по профилактике холеры, чумы, оспы, паразитарных тифов, бешенства). Открыл бактериолизины, возбудители холеры птиц. Обосновал значение дезинсекции для ликвидации сыпного и возвратного тифов. В 1888 году ученый издал книгу "О прививках против сибирской язвы".
Здровский (1890-1976 года), российский микробиолог, иммунолог и эпидемиолог, академик АМН. Исследования по проблемам тропических болезней, бруцеллеза и др. Под руководством Здродовского разработаны методы вакцинации против столбняка, дифтерии и др. инфекций. Автор книги "Учение о риккетсиях и риккетсиозах"
Смородинцев, российский вирусолог и иммунолог. Труды по этиологии и профилактике гриппа, энцефалитов и др. вирусных инфекций. Совместно с М. П. Чумаковым разработал и внедрил вакцину против полиомиелита.
Ермольева, российский микробиолог. Получила первые отечественные образцы антибиотиков - пенициллина, стрептомицина и др.; интерферона.
Жданов, российский вирусолог. Труды по вирусным инфекциям, молекулярной биологии и классификации вирусов, эволюции инфекционных болезней.
Врожденный, иди видовой, иммунитет, он же наследственный, генетический, конституциональный — это выработанная в процессе филогенеза генетически закрепленная, передающаяся по наследству невосприимчивость данного вида и его индивидов к какому-либо антигену (или микроорганизму), обусловленная биологическими особенностями самого организма, свойствами данного антигена, а также особенностями их взаимодействия.
Примером может служить невосприимчивость человека к некоторым возбудителям, в том числе к особо опасным для сельскохозяйственных животных (чума крупного рогатого скота, болезнь Ньюкасла, поражающая птиц, оспа лошадей и др.), нечувствительность человека к бактериофагам, поражающим клетки бактерий. К генетическому иммунитету можно также отнести отсутствие взаимных иммунных реакций на тканевые антигены у однояйцовых близнецов; различают чувствительность к одним и тем же антигенам у различных линий животных, т. е. животных с различным генотипом.
Объяснить видовой иммунитет можно с разных позиций, прежде всего отсутствием у того или иного вида рецепторного аппарата, обеспечивающего первый этап взаимодействия данного антигена с клетками или молекулами-мишенями, определяющими запуск патологического процесса или активацию иммунной системы. Не исключены также возможность быстрой деструкции антигена, например, ферментами организма или же отсутствие условий для приживления и размножения микроба (бактерий, вирусов) в организме. В конечном итоге это обусловлено генетическими особенностями вида, в частности отсутствием генов иммунного ответа к данному антигену.
Видовой иммунитет может быть абсолютным и относительным. Например, нечувствительные к столбнячному токсину лягушки могут реагировать на его введение, если повысить температуру их тела. Белые мыши, не чувствительные к какому-либо антигену, приобретают способность реагировать на него, если воздействовать на них иммунодепрессантами или удалить у них центральный орган иммунитета — тимус.
Природа и характеристика комплемента. Комплемент является одним из важных факторов гуморального иммунитета, играющим роль в защите организма от антигенов. Комплемент представляет собой сложный комплекс белков сыворотки крови, находящийся обычно в неактивном состоянии и активирующийся при соединении антигена с антителом или при агрегации антигена. В состав комплемента входят 20 взаимодействующих между собой белков, девять из которых являются основными компонентами комплемента; их обозначают цифрами: С1, С2, СЗ, С4... С9. Важную роль играют также факторы В, D и Р (пропердин). Белки комплемента относятся к глобулинам и отличаются между собой по ряду физико-химических свойств. В частности, они существенно различаются по молекулярной массе, а также имеют сложный субъединичный состав: Cl-Clq, Clr, Cls; СЗ-СЗа, СЗЬ; С5-С5а, С5b и т. д. Компоненты комплемента синтезируются в большом количестве (составляют 5—10% от всех белков крови), часть из них образуют фагоциты.
Функции комплемента многообразны: а) участвует в лизисе микробных и других клеток (цитотоксическое действие); б) обладает хемотаксической активностью; в) принимает участие в анафилаксии; г) участвует в фагоцитозе. Следовательно, комплемент является компонентом многих иммунологических реакций, направленных на освобождение организма от микробов и других чужеродных клеток и антигенов (например, опухолевых клеток, трансплантата).
Механизм активации комплемента очень сложен и представляет собой каскад ферментативных протеолитических реакций, в результате которого образуется активный цитолитический комплекс, разрушающий стенку бактерии и других клеток. Известны три пути активации комплемента: классический, альтернативный и лектиновый.
По классическому пути комплемент активируется комплексом антиген-антитело. Для этого достаточно участия в связывании антигена одной молекулы IgM или двух молекул IgG. Процесс начинается с присоединения к комплексу АГ+АТ компонента С1, который распадается на субъединицы Clq, Clr и С Is. Далее в реакции участвуют последовательно активированные «ранние» компоненты комплемента в такой последовательности: С4, С2, СЗ. Эта реакция имеет характер усиливающегося каскада, т. е. когда одна молекула предыдущего компонента активирует несколько молекул последующего. «Ранний» компонент комплемента С3 активирует компонент С5, который обладает свойством прикрепляться к мембране клетки. На компоненте С5 путем последовательного присоединения «поздних» компонентов С6, С7, С8, С9 образуется литический или мембраноатакующий комплекс который нарушает целостность мембраны (образует в ней отверстие), и клетка погибает в результате осмотического лизиса.
Альтернативный путь активации комплемента проходит без участия антител. Этот путь характерен для защиты от грамотрицательных микробов. Каскадная цепная реакция при альтернативном пути начинается с взаимодействия антигена (например, полисахарида) с протеинами В, D и пропердином (Р) с последующей активацией компонента СЗ. Далее реакция идет так же, как и при классическом пути — образуется мембраноатакующий комплекс.
Лектиновыи путь активации комплемента также происходит без участия антител. Он инициируется особым маннозосвязывающим белком сыворотки крови, который после взаимодействия с остатками маннозы на поверхности микробных клеток катализирует С4. Дальнейший каскад реакций сходен с классическим путем.
В процессе активации комплемента образуются продукты протеолиза его компонентов — субъединицы СЗа и СЗb, С5а и С5b и другие, которые обладают высокой биологической активностью. Например, СЗа и С5а принимают участие в анафилактических реакциях, являются хемоаттрактантами, СЗb — играет роль в опсонизации объектов фагоцитоза, и т. д. Сложная каскадная реакция комплемента происходит с участием ионов Са2+ и Mg2+.
76. Клеточные факторы врожденного иммунитета. Фагоцитоз. Естественные киллеры.
Иммунокомпетентные клетки - клетки, способные специфически распознавать антиген и отвечать на него иммунной реакцией. Такими клетками являются Т- и В-лимфоциты (тимусзависимые и костномозговые лимфоциты), которые под влиянием чужеродных агентов дифференцируются в сенсибилизированный лимфоцит и плазматическую клетку.
Т-лимфоциты – это сложная по составу группа клеток, которая происходит от полипотентной стволовой клетки костного мозга, а созревает и дифференцируется в тимусе из предшественников. Т-лимфоциты разделяются на две субпопуляции: иммунорегуляторы и эффекторы. Задачу регуляции иммунного ответа выполняют Т-хелперы. Эффекторную функцияю осуществляют Т-киллеры и естественные киллеры. В орагнизме Т-лимфоциты обеспечивают клеточные формы иммунного ответа, определяют силу и продолжительность иммунной реакции.
B-лимфоциты – преимущественно эффекторные иммунокомпетентные клетки. Зрелые В-лимфоциты и их потомки – плазматические клетки являются антителопродуцентами. Их основными продуктами являются иммуноглобулины. В-лимфоциты участвуют в формировании гуморального иммунитета, В-клеточной иммунологической памяти и гиперчувствительности немедленного типа.
Макрофаги - клетки соединительной ткани, способные к активному захвату и перевариванию бактерий, остатков клеток и других чужеродных для организма частиц. Основная функция макрофагов сводится к борьбе с теми бактериями, вирусами и простейшими, которые могут существовать внутри клетки-хозяина, при помощи мощных бактерицидных механизмов. Роль макрофагов в иммунитете исключительно важна - они обеспечивают фагоцитоз, переработку и представление антигена T-клеткам.
Кооперация иммунокомпетентных клеток. Иммунная реакция организма может иметь различный характер, но всегда начинается с захвата антигена макрофагами крови и тканей или же со связывания со стромой лимфоидных органов. Нередко антиген адсорбируется также на клетках паренхиматозных органов. В макрофагах он может полностью разрушаться, но чаше подвергается лишь частичной деградации. В частности, большинство антигенов в лизосомах фагоцитов в печение часа подвергается ограниченной денатурации и протеолизу. Оставшиеся от них пептиды (как правило, два-три остатка аминокислот) комплексируются с экспрессированными на внешней мембране макрофагов молекулами МНС.
Макрофаги и все другие вспомогательные клетки, несущие на внешней мембране антигены, называются антигенпрезентирующими, именно благодаря им Т- и В-лимфоциты, выполняя функцию презентации, позволяют быстро распознавать антиген.
Иммунный ответ в виде антителообразования происходит при распознавании В-клетками антигена, который индуцирует их пролиферацию и дифференциацию в плазмоцит. Прямое воздействие на В-клетку без участия Т-клеток могут оказать только тимуснезависимые антигены. В этом случае В-клетки кооперируются с Т-хелперами и макрофагами. Кооперация на тимусза-висимый антиген начинается с его презентации на макрофаге Т-хелперу. В механизме этого распознавания ключевую роль имеют молекулы МНС, так как рецепторы Т-хелперов распознают номинальный антиген как комплекс в целом или же как модифицированные номинальным антигеном молекулы МНС, приобретшие чужеродность. Распознав антиген, Т-хелперы секретируют γ-интерферон, который активирует макрофаги и способствует уничтожению захваченных ими микроорганизмов. Хелперный эффект на В-клетки проявляется пролиферацией и дифференциацией их в плазмоциты. В распознавании антигена при клеточном характере иммунного ответа, кроме Т-хелперов, участвуют также Т-киллеры, которые обнаруживают антиген на тех антигенпрезентирующих клетках, где он комплексируется с молекулами МНС. Более того, Т-киллеры, обусловливающие цитолиз, способны распознавать не только трансформированный, но и нативный антиген. Приобретая способность вызывать цитолиз, Т-киллеры связываются с комплексом антиген + молекулы МНС класса 1 на клетках-мишенях; привлекают к месту соприкосновения с ними цитоплазма-тические гранулы; повреждают мембраны мишеней после экзоцитоза их содержимого.
В результате продуцируемые Т-киллерами лимфотоксины вызывают гибель всех трансформированных клеток организма, причем особенно чувствительны к нему клетки, зараженные вирусом. При этом наряду с лимфотоксином активированные Т-киллеры синтезируют интерферон, который препятствует проникновению вирусов в окружающие клетки и индуцирует в клетках образование рецепторов лимфотоксина, тем самым повышая их чувствительность к литическому действию Т-киллеров.
Кооперируясь в распознавании и элиминации антигенов, Т-хелперы и Т-киллеры не только активируют друг друга и своих предшественников, но и макрофагов. Те же, в свою очередь, стимулируют активность различных субпопуляций лимфоцитов.
Регуляция клеточного иммунного ответа, как и гуморального, осуществляется Т-супрессорами, которые воздействуют на пролиферацию цитотоксических и антигенпрезентирующих клеток.
Цитокины. Все процессы кооперативных взаимодействий им-мунокомпетентных клеток, независимо от характера иммунного ответа, обусловливаются особыми веществами с медиаторными свойствами, которые секретируются Т-хелперами, Т-киллерами, мононуклеарными фагоцитами и некоторыми другими клетками, участвующими в реализации клеточного иммунитета. Все их многообразие принято называть цитокинами. По структуре цитокины являются протеинами, а по эффекту действия — медиаторами. Вырабатываются они при иммунных реакциях и обладают потенциирующим и аддитивным действием; быстро синтезируясь, цитокины расходуются в короткие сроки. При угасании иммунной реакции синтез цитокинов прекращается.
77. Антигены и их характеристика.
Антиген – это биополимер органической природы, генетически чужеродный для макроорганизма, который при попадании в последний распознаётся его иммунной системой и вызывает иммунные реакции, направленные на его устранение.
Антигены обладают рядом характерных свойств: антигенностью, специфичностью и иммуногенностью.
Антигенность. Под антигенностью понимают потенциальную способность молекулы антигена активировать компоненты иммунной системы и специфически взаимодействовать с факторами иммунитета (антитела, клон эффекторных лимфоцитов). Иными словами, антиген должен выступать специфическим раздражителем по отношению к иммунокомпетентным клеткам. При этом взаимодействие компоненты иммунной системы происходит не со всей молекулой одновременно, а только с ее небольшим участком, который получил название «антигенная детерминанта», или «эпитоп».
Чужеродность является обязательным условием для реализации антигенности. По этому критерию система приобретенного иммунитета дифференцирует потенциально опасные объекты биологического мира, синтезированные с чужеродной генетической матрицы. Понятие «чужеродность» относительное, так как имму-нокомпетентные клетки не способны напрямую анализировать чужеродный генетический код. Они воспринимают лишь опосредованную информацию, которая, как в зеркале, отражена в молекулярной структуре вещества.
Иммуногенность — потенциальная способность антигена вызывать по отношению к себе в макроорганизме специфическую защитную реакцию. Степень иммуногенности зависит от ряда факторов, которые можно объединить в три группы: 1. Молекулярные особенности антигена; 2. Клиренс антигена в организме; 3. Реактивность макроорганизма.
К первой группе факторов отнесены природа, химический состав, молекулярный вес, структура и некоторые другие характеристики.
Иммуногенность в значительной степени зависит от природы антигена. Важна также оптическая изомерия аминокислот, составляющих молекулу белка. Большое значение имеет размер и молекулярная масса антигена. На степень иммуногенности также оказывает влияние пространственная структура антигена. Оказалась также существенной стерическая стабильность молекулы антигена. Еще одним важным условием иммуногенности является растворимость антигена.
Вторая группа факторов связана с динамикой поступления антигена в организм и его выведения. Так, хорошо известна зависимость иммуногенности антигена от способа его введения. На иммунный ответ влияет количество поступающего антигена: чем его больше, тем более выражен иммунный ответ.
Третья группа объединяет факторы, определяющие зависимость иммуногенности от состояния макроорганизма. В этой связи на первый план выступают наследственные факторы.
Специфичностью называют способность антигена индуцировать иммунный ответ к строго определенному эпитопу. Это свойство обусловлено особенностями формирования иммунного ответа — необходима комплементарность рецепторного аппарата иммунокомпетентных клеток к конкретной антигенной детерминанте. Поэтому специфичность антигена во многом определяется свойствами составляющих его эпитопов. Однако при этом следует учитывать условность границ эпитопов, их структурное разнообразие и гетерогенность клонов антигенреактивных лимфоцитовой специфичности. В результате этого организм на антигенное раздражение всегда отвечает поликлональными иммунным ответом.
78. Антигенная структура бактериальной клетки.
Антигены бактериальной клетки. В структуре бактериальной клетки различают жгутиковые, соматические, капсульные и некоторые другие антигены. Жгутиковые, или Н-антигены, локализуются в локомоторном аппарате бактерий — их жгутиках. Они представляют собой эпитопы сократительного белка флагеллина. При нагревании флагеллин денатурирует, и Н-антиген теряет свою специфичность. Фенол не действует на этот антиген.
Соматический, или О-антиген, связан с клеточной стенкой бактерий. Его основу составляют ЛПС. О-антиген проявляет термостабильные свойства — он не разрушается при длительном кипячении. Однако соматический антиген подвержен действию альдегидов (например, формалина) и спиртов, которые нарушают его структуру.
Капсулъные, или К-антигены, располагаются на поверхности клеточной стенки. Встречаются у бактерий, образующих капсулу. Как правило, К-антигены состоят из кислых полисахаридов (уроновые кислоты). В то же время у бациллы сибирской язвы этот антиген построен из полипептидных цепей. По чувствительности к нагреванию различают три типа К-антигена: А, В, и L. Наибольшая термостабильность характерна для типа А, он не денатурирует даже при длительном кипячении. Тип В выдерживает непродолжительное нагревание (около 1 часа) до 60 "С. Тип L быстро разрушается при этой температуре. Поэтому частичное удаление К-антигена возможно путем длительного кипячения бактериальной культуры.
На поверхности возбудителя брюшного тифа и других энтеробактерий, которые обладают высокой вирулентностью, можно обнаружить особый вариант капсульного антигена. Он получил название антигена вирулентности, или Vi-антигена. Обнаружение этого антигена или специфичных к нему антител имеет большое диагностическое значение.
Антигенными свойствами обладают также бактериальные белковые токсины, ферменты и некоторые другие белки, которые секретируются бактериями в окружающую среду (например, туберкулин). При взаимодействии со специфическими антителами токсины, ферменты и другие биологически активные молекулы бактериального происхождения теряют свою активность. Столбнячный, дифтерийный и ботулинический токсины относятся к числу сильных полноценных антигенов, поэтому их используют для получения анатоксинов для вакцинации людей.
В антигенном составе некоторых бактерий выделяется группа антигенов с сильно выраженной иммуногенностью, чья биологическая активность играет ключевую роль в формировании патогенности возбудителя. Связывание таких антигенов специфическими антителами практически полностью инактивирует вирулентные свойства микроорганизма и обеспечивает иммунитет к нему. Описываемые антигены получили название протективных. Впервые протективный антиген был обнаружен в гнойном отделяемом карбункула, вызванного бациллой сибирской язвы. Это вещество является субъединицей белкового токсина, которая ответственна за активацию других, собственно вирулентных субъединиц — так называемого отечного и летального факторов.
79. Иммуноглобулины и антитела. Возрастные особенности иммунологической реактивности. Динамика антителообразования в развивающемся организме.
Природа иммуноглобулинов. В ответ на введение антигена иммунная система вырабатывает антитела — белки, способные специфически соединяться с антигеном, вызвавшим их образование, и таким образом участвовать в иммунологических реакциях. Относятся антитела к γ-глобулинам, т. е. наименее подвижной в электрическом поле фракции белков сыворотки крови. В организме γ-глобулины вырабатываются особыми клетками — плазмоцитами. γ-глобулины, несущие функции антител, получили название иммуноглобулинов и обозначаются символом Ig. Следовательно, антитела — это иммуноглобулины, вырабатываемые в ответ на введение антигена и способные специфически взаимодействовать с этим же антигеном.
Функции. Первичная функция состоит во взаимодсйствии их активных центров с комплементарными им детерминантами антигенов. Вторичная функция состоит в их способности:
• связывать антиген с целью его нейтрализации и элиминации из организма, т. е. принимать участие в формировании защиты от антигена;
• участвовать в распознавании «чужого» антигена;
• обеспечивать кооперацию иммунокомпетентных клеток (макрофагов, Т- и В-лимфоцитов);
• участвовать в различных формах иммунного ответа (фагоцитоз, киллерная функция, ГНТ, ГЗТ, иммунологическая толерантность, иммунологическая память).
Структура антител. Белки иммуноглобулинов по химическому составу относятся к гликопротеидам, так как состоят из протеина и Сахаров; построены из 18 аминокислот. Имеют видовые отличия, связанные главным образом с набором аминокислот. Их молекулы имеют цилиндрическую форму, они видны в электронном микроскопе. До 80 % иммуноглобулинов имеют константу седиментации 7S; устойчивы к слабым кислотам, щелочам, нагреванию до 60 °С. Выделить иммуноглобулины из сыворотки крови можно физическими и химическими методами (электрофорез, изоэлектрическое осаждение спиртом и кислотами, высаливание, аффинная хроматография и др.). Эти методы используют в производстве при приготовлении иммунобиологических препаратов.
Иммуноглобулины по структуре, антигенным и иммунобиологическим свойствам разделяются на пять классов: IgM, IgG, IgA, IgE, IgD. Иммуноглобулины М, G, А имеют подклассы. Например, IgG имеет четыре подкласса (IgG,, IgG2, IgG3, IgG4). Все классы и подклассы различаются по аминокислотной последовательности.
Молекулы иммуноглобулинов всех пяти классов состоят из полипептидных цепей: двух одинаковых тяжелых цепей Н и двух одинаковых легких цепей — L, соединенных между собой дисульфидными мостиками. Соответственно каждому классу иммуноглобулинов, т.е. М, G, A, E, D, различают пять типов тяжелых цепей: μ (мю), γ (гамма), α (альфа), ε (эпсилон) и Δ (дельта), различающихся по антигенности. Легкие цепи всех пяти классов являются общими и бывают двух типов: κ (каппа) и λ (ламбда); L-цепи иммуноглобулинов различных классов могут вступать в соединение (рекомбинироваться) как с гомологичными, так и с гетерологичными Н-цепями. Однако в одной и той же молекуле могут быть только идентичные L-цепи (κ или λ). Как в Н-, так и в L-цепях имеется вариабельная — V область, в которой последовательность аминокислот непостоянна, и константная — С область с постоянным набором аминокислот. В легких и тяжелых цепях различают NH2- и СООН-концевые группы.
При обработке γ -глобулина меркаптоэтанолом разрушаются дисульфидные связи и молекула иммуноглобулина распадается на отдельные цепи полипептидов. При воздействии протеолитическим ферментом папаином иммуноглобулин расщепляется на три фрагмента: два не кристаллизующихся, содержащих детерминантные группы к антигену и названных Fab-фрагментами I и II и один кристаллизующий Fc-фрагмент. FabI- и FabII-фрагменты сходны по свойствам и аминокислотному составу и отличаются от Fc-фрагмента; Fab-и Fc-фрагменты являются компактными образованиями, соединенными между собой гибкими участками Н-цепи, благодаря чему молекулы иммуноглобулина имеют гибкую структуру.
Как Н-цепи, так и L-цепи имеют отдельные, линейно связанные компактные участки, названные доменами; в Н-цепи их по 4, а в L-цепи — по 2.
Активные центры, или детерминанты, которые формируются в V-областях, занимают примерно 2 % поверхности молекулы иммуноглобулина. В каждой молекуле имеются две детерминанты, относящиеся к гипервариабельным участкам Н-и L-цепей, т. е. каждая молекула иммуноглобулина может связать две молекулы антигена. Поэтому антитела являются двухвалентными.
Типовой структурой молекулы иммуноглобулина является IgG. Остальные классы иммуноглобулинов отличаются от IgG дополнительными элементами организации их молекулы.
В ответ на введение любого антигена могут вырабатываться антитела всех пяти классов. Обычно вначале вырабатывается IgM, затем IgG, остальные — несколько позже.
Иммуноглобулины по структуре, антигенным и иммунобиологическим свойствам разделяются на пять классов: IgM, IgG, IgA, IgE, IgD.
Иммуноглобулин класса G. Изотип G составляет основную массу Ig сыворотки крови. На его долю приходится 70—80 % всех сывороточных Ig, при этом 50 % содержится в тканевой жидкости. Среднее содержание IgG в сыворотке крови здорового взрослого человека 12 г/л. Период полураспада IgG — 21 день.
IgG — мономер, имеет 2 антигенсвязывающих центра (может одновременно связать 2 молекулы антигена, следовательно, его валентность равна 2), молекулярную массу около 160 кДа и константу седиментации 7S. Различают подтипы Gl, G2, G3 и G4. Синтезируется зрелыми В-лимфоцитами и плазматическими клетками. Хорошо определяется в сыворотке крови на пике первичного и при вторичном иммунном ответе.
Обладает высокой аффинностью. IgGl и IgG3 связывают комплемент, причем G3 активнее, чем Gl. IgG4, подобно IgE, обладает цитофильностью (тропностью, или сродством, к тучным клеткам и базофилам) и участвует в развитии аллергической реакции I типа. В иммунодиагностических реакциях IgG может проявлять себя как неполное антитело.
Легко проходит через плацентарный барьер и обеспечивает гуморальный иммунитет новорожденного в первые 3—4 месяца жизни. Способен также выделяться в секрет слизистых, в том числе в молоко путем диффузии.
IgG обеспечивает нейтрализацию, опсонизацию и маркирование антигена, осуществляет запуск комплемент-опосредованного цитолиза и антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности.
Иммуноглобулин класса М. Наиболее крупная молекула из всех Ig. Это пентамер, который имеет 10 антигенсвязывающих центров, т. е. его валентность равна 10. Молекулярная масса его около 900 кДа, константа седиментации 19S. Различают подтипы Ml и М2. Тяжелые цепи молекулы IgM в отличие от других изотипов построены из 5 доменов. Период полураспада IgM — 5 дней.
На его долю приходится около 5—10 % всех сывороточных Ig. Среднее содержание IgM в сыворотке крови здорового взрослого человека составляет около 1 г/л. Этот уровень у человека достигается уже к 2—4-летнему возрасту.
IgM филогенетически — наиболее древний иммуноглобулин. Синтезируется предшественниками и зрелыми В-лимфоцитами. Образуется в начале первичного иммунного ответа, также первым начинает синтезироваться в организме новорожденного — определяется уже на 20-й неделе внутриутробного развития.
Обладает высокой авидностью, наиболее эффективный активатор комплемента по классическому пути. Участвует в формировании сывороточного и секреторного гуморального иммунитета. Являясь полимерной молекулой, содержащей J-цепь, может образовывать секреторную форму и выделяться в секрет слизистых, в том числе в молоко. Большая часть нормальных антител и изоагглютининов относится к IgM.
Не проходит через плаценту. Обнаружение специфических антител изотипа М в сыворотке крови новорожденного указывает на бывшую внутриутробную инфекцию или дефект плаценты.
IgM обеспечивает нейтрализацию, опсонизацию и маркирование антигена, осуществляет запуск комплемент-опосредованного цитолиза и антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности.
Иммуноглобулин класса А. Существует в сывороточной и секреторной формах. Около 60 % всех IgA содержится в секретах слизистых.
Сывороточный IgA: На его долю приходится около 10—15% всех сывороточных Ig. В сыворотке крови здорового взрослого человека содержится около 2,5 г/л IgA, максимум достигается к 10-летнему возрасту. Период полураспада IgA — 6 дней.
IgA — мономер, имеет 2 антигенсвязывающих центра (т. е. 2-валентный), молекулярную массу около 170 кДа и константу седиментации 7S. Различают подтипы А1 и А2. Синтезируется зрелыми В-лимфоцитами и плазматическими клетками. Хорошо определяется в сыворотке крови на пике первичного и при вторичном иммунном ответе.
Обладает высокой аффинностью. Может быть неполным антителом. Не связывает комплемент. Не проходит через плацентарный барьер.
IgA обеспечивает нейтрализацию, опсони-зацию и маркирование антигена, осуществляет запуск антителозависимой клеточно-опос-редованной цитотоксичности.
Секреторный IgA: В отличие от сывороточного, секреторный sIgA существует в полимерной форме в виде ди- или тримера (4- или 6-валентный) и содержит J- и S-пeптиды. Молекулярная масса 350 кДа и выше, константа седиментации 13S и выше.
Синтезируется зрелыми В-лимфоцитами и их потомками — плазматическими клетками соответствующей специализации только в пределах слизистых и выделяется в их секреты. Объем продукции может достигать 5 г в сутки. Пул slgA считается самым многочисленным в организме — его количество превышает суммарное содержание IgM и IgG. В сыворотке крови не обнаруживается.
Секреторная форма IgA — основной фактор специфического гуморального местного иммунитета слизистых оболочек желудочно-кишечного тракта, мочеполовой системы и респираторного тракта. Благодаря S-цепи он устойчив к действию протеаз. slgA не активирует комплемент, но эффективно связывается с антигенами и нейтрализует их. Он препятствует адгезии микробов на эпителиальных клетках и генерализации инфекции в пределах слизистых.
Иммуноглобулин класса Е. Называют также реагином. Содержание в сыворотке крови крайне невысоко — примерно 0,00025 г/л. Обнаружение требует применения специальных высокочувствительных методов диагностики. Молекулярная масса — около 190 кДа, константа седиментации — примерно 8S, мономер. На его долю приходится около 0,002 % всех циркулирующих Ig. Этот уровень достигается к 10—15 годам жизни.
Синтезируется зрелыми В-лимфоцитами и плазматическими клетками преимущественно в лимфоидной ткани бронхолегочного дерева и ЖКТ.
Не связывает комплемент. Не проходит через плацентарный барьер. Обладает выраженной цитофильностью — тропностью к тучным клеткам и базофилам. Участвует в развитии гиперчувствительности немедленного типа — реакция I типа.
Иммуноглобулин класса D. Сведений об Ig данного изотипа не так много. Практически полностью содержится в сыворотке крови в концентрации около 0,03 г/л (около 0,2 % от общего числа циркулирующих Ig). IgD имеет молекулярную массу 160 кДа и константу седиментации 7S, мономер.
Не связывает комплемент. Не проходит через плацентарный барьер. Является рецептором предшественников В-лимфоцитов.
80. Понятие об иммунитете. Иммунная система организма человека и ее основные функции.
Иммунитет (immunitas – освобождение от чего-либо) – совокупность реакций организма, направленных на сохранение его целостности при воздействии на него генетически чужеродных структур, в том числе микроорганизмов. Функции иммунитета выполняет иммунная система, состоящая из лимфоидной ткани.
Сопротивляемость организма к инфекции зависит не только от специфического ответа на определенный генетически чужеродный агент, но и от ряда неспецифических факторов - непроницаемости кожных и слизистых покровов для микроорганизмов, кислотности желудочного сока, присутствия в крови и других жидкостях организма (слюна, слезы и др.) бактерицидных систем (комплемент, пропердин, лизоцим). Важным фактором неспецифической защиты организма является фагоцитоз – процесс поглощения и переваривания генетически чужеродных веществ клетками- фагоцитами из системы макрофагов.
81. Первичный и вторичный иммунный ответ.
Способность к образованию антител появляется во внутриутробном периоде у 20-недельного эмбриона; после рождения начинается собственная продукция иммуноглобулинов, которая увеличивается до наступления зрелого возраста и несколько снижается к старости. Динамика образования антител имеет различный характер в зависимости от силы антигенного воздействия (дозы антигена), частоты воздействия антигена, состояния организма и его иммунной системы. При первичном и повторном введении антигена динамика антителообразования также различна и протекает в несколько стадий. Выделяют латентную, логарифмическую, стационарную фазу и фазу снижения.
В латентной фазе происходят переработка и представление антигена иммунокомпетентным клеткам, размножение клона клеток, специализированного на выработку антител к данному антигену, начинается синтез антител. В этот период антитела в крови не обнаруживаются.
Во время логарифмической фазы синтезированные антитела высвобождаются из плазмоцитов и поступают в лимфу и кровь.
В стационарной фазе количество антител достигает максимума и стабилизируется, затем наступает фаза снижения уровня антител. При первичном введении антигена (первичный иммунный ответ) латентная фаза составляет 3—5 сут, логарифмическая — 7— 15 сут, стационарная — 15—30 сут и фаза снижения — 1—6 мес и более. Особенностью первичного иммунного ответа является то, что первоначально синтезируется IgM, а затем IgG.
В отличие от первичного иммунного ответа при вторичном введении антигена (вторичный иммунный ответ) латентный период укорочен до нескольких часов или 1—2 сут, логарифмическая фаза характеризуется быстрым нарастанием и значительно более высоким уровнем антител, который в последующих фазах длительно удерживается и медленно, иногда в течение нескольких лет, снижается. При вторичном иммунном ответе в отличие от первичного синтезируются главным образом IgG.
Такое различие динамики антителообразования при первичном и вторичном иммунном ответе объясняется тем, что после первичного введения антигена в иммунной системе формируется клон лимфоцитов, несущих иммунологическую память о данном антигене. После повторной встречи с этим же антигеном клон лимфоцитов с иммунологической памятью быстро размножается и интенсивно включает процесс антителогенеза.
Очень быстрое и энергичное антителообразование при повторной встрече с антигеном используется в практических целях при необходимости получения высоких титров антител при производстве диагностических и лечебных сывороток от иммунизированных животных, а также для экстренного создания иммунитета при вакцинации.
82. Гибридомы и моноклональные антитела.
Моноклональные антитела. Каждый В-лимфоцит и его потомки, образовавшиеся в результате пролиферации (т.е. клон), способны синтезировать антитела с паратопом строго определенной специфичности. Такие антитела получили название моноклональных. В природных условиях макроорганизма получить моноклональные антитела практически невозможно. Дело в том, что на одну и ту же антигенную детерминанту одновременно реагируют до 100 различных клонов В-лимфоцитов, незначительно различающихся антигенной специфичностью рецепторов и, естественно, аффинностью. Поэтому в результате иммунизации даже монодетерминантным антигеном мы всегда получаем политональные антитела.
Принципиально получение моноклональных антител выполнимо, если провести предварительную селекцию антителопродуцирующих клеток и их клонирование (т.е. выделение отдельных клонов в чистые культуры). Однако задача осложняется тем, что В-лимфоциты, как и другие эукариотические клетки, имеют ограниченную продолжительность жизни и число возможных митотических делений.
Проблема получения моноклональных антител была успешно решена Д. Келлером и Ц. Милыптейном. Авторы получили гибридные клетки путем слияния иммунных В-лимфоцитов с миеломной (опухолевой) клеткой. Полученные гибриды обладали специфическими свойствами антителопро-дуцента и «бессмертием» раковотрансформированной клетки. Такой вид клеток получил название гибридом. Гибридома хорошо размножается в искусственных питательных средах и в организме животных и в неограниченном количестве вырабатывает антитела. В результате дальнейшей селекции были отобраны отдельные клоны гибридных клеток, обладавшие наивысшей продуктивностью и наибольшей аффинностью специфических антител.
Гибридомы, продуцирующие моноклональые антитела, размножают или в аппаратах, приспособленных для выращивания культур клеток или же вводя их внутрибрюшинно особой линии (асцитным) мышам. В последнем случае моноклональные антитела накапливаются в асцитной жидкости, в которой размножаются губридомы. Полученные как тем, так и другим способом моноклональные антитела подвергают очистке, стандартизации и используют для создания на их основе диагностических препаратов.
Гибридомные моноклональные антитела нашли широкое применение при создании диагностических и лечебных иммунобиологических препаратов.
83. Особенности антибактериального, антитоксического и противовирусного иммунитета.
Противовирусный иммунитет. Основой противовирусного иммунитета является клеточный иммунитет. Клетки-мишени, инфицированные вирусом, уничтожаются цитотоксическими лимфоцитами, а также NK-клетками и фагоцитами, взаимодействующими с Fc-фрагментами антител, прикрепленных к вирусспецифическим белкам инфицированной клетки. Противовирусные антитела способны нейтрализовать только внеклеточно расположенные вирусы, как и факторы неспецифического иммунитета — сывороточные противовирусные ингибиторы. Такие вирусы, окруженные и блокированные белками организма, поглощаются фагоцитами или выводятся с мочой, потом и др. (так называемый «выделительный иммунитет»). Интерфероны усиливают противовирусную резистентность, индуцируя в клетках синтез ферментов, подавляющих образование нуклеиновых кислот и белков вирусов. Кроме этого, интерфероны оказывают иммуномодулирующее действие, усиливают в клетках экспрессию антигенов главного комплекса гистосовместимости (МНС). Противовирусная защита слизистых оболочек обусловлена секреторными IgA, которые, взаимодействуя с вирусами, препятствуют их адгезии на эпителиоцитах.
Противобактериальный иммунитет направлен как против бактерий, так и против их токсинов (антитоксический иммунитет). Бактерии и их токсины нейтрализуются антибактериальными и антитоксическими антителами. Комплексы бактерия (антигены)-антитела активируют комплемент, компоненты которого присоединяются к Fc-фрагменту антитела, а затем образуют мембраноатакующий комплекс, разрушающий наружную мембрану клеточной стенки грамотрицательных бактерий. Пептидогликан клеточных стенок бактерий разрушается лизоцимом. Антитела и комплемент (СЗЬ) обволакивают бактерии и «приклеивают» их к Fc- и С3b-рецепторам фагоцитов, выполняя роль опсонинов вместе с другими белками, усиливающими фагоцитоз (С-реактивным белком, фибриногеном, маннан-связывающим лектином, сывороточным амилоидом).
Основным механизмом антибактериального иммунитета является фагоцитоз. Фагоциты направленно перемещаются к объекту фагоцитоза, реагируя на хемоаттрактанты: вещества микробов, активированные компоненты комплемента (С5а, С3а) и цитокины. Противобактериальная защита слизистых оболочек обусловлена секреторными IgA, которые, взаимодействуя с бактериями, препятствуют их адгезии на эпителиоцитах.
Противогрибковый иммунитет. Антитела (IgM, IgG) при микозах выявляются в низких титрах. Основой противогрибкового иммунитета является клеточный иммунитет. В тканях происходит фагоцитоз, развивается эпителиоидная гранулематозная реакция, иногда тромбоз кровеносных сосудов. Микозы, особенно оппортунистические, часто развиваются после длительной антибактериальной терапии и при иммунодефицитах. Они сопровождаются развитием гиперчувствительности замедленного типа. Возможно развитие аллергических заболеваний после реcпираторной сенсибилизации фрагментами условно-патогенных грибов родов Aspergillus, Penicillium, Mucor, Fusarium и др.
Противоопухолевый иммунитет основан на Th1-зависимом клеточном иммунном ответе, активирующем цитотоксические Т-лимфоциты, макрофаги и NK-клетки. Роль гуморального (антительного) иммунного ответа невелика, поскольку антитела, соединяясь с антигенными детерминантами на опухолевых клетках, экранируют их от цитопатогенного действиях иммунных лимфоцитов. Опухолевый антиген распознается антигенпрезентирующими клетками (дендритными клетками и макрофагами) и непосредственно или через Т-хелперы (Th1) представляется цитотоксическим Т-лимфоцитам, разрушающим опухолевую клетку-мишень.
Кроме специфического противоопухолевого иммунитета, иммунный надзор за нормальным составом тканей реализуется за счет неспецифических факторов. Неспецифические факторы, повреждающие опухолевые клетки: 1) NK-клетки, система мононуклеарных клеток, противоопухолевая активность которых усиливается под воздействием интерлейкина-2 (ИЛ-2) и α-, β-интерферонов; 2) ЛАК-клетки (мононуклеарные клетки и NK-клетки, активированные ИЛ-2); 3) цитокины (α - и β -интерфероны, ФНО- α и ИЛ-2).
Трансплантационным иммунитетом называют иммунную реакцию макроорганизма, направленную против пересаженной в него чужеродной ткани (трансплантата). Знание механизмов трансплантационного иммунитета необходимо для решения одной из важнейших проблем современной медицины — пересадки органов и тканей. Многолетний опыт показал, что успех операции по пересадке чужеродных органов и тканей в подавляющем большинстве случаев зависит от иммунологической совместимости тканей донора и реципиента.
Иммунная реакция на чужеродные клетки и ткани обусловлена тем, что в их составе содержатся генетически чужеродные для организма антигены. Эти антигены, получившие название трансплантационных или антигенов гистосовместимости, наиболее полно представлены на ЦПМ клеток.
Реакция отторжения не возникает в случае полной совместимости донора и реципиента по антигенам гистосовместимости — такое возможно лишь для однояйцовых близнецов. Выраженность реакции отторжения во многом зависит от степени чужеродности, объема трансплантируемого материала и состояния иммунореактивности реципиента.
При контакте с чужеродными трансплантационными антигенами организм реагирует факторами клеточного и гуморального звеньев иммунитета. Основным фактором клеточного трансплантационного иммунитета являются Т-киллеры. Эти клетки после сенсибилизации антигенами донора мигрируют в ткани трансплантата и оказывают на них антителонезависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность.
Специфические антитела, которые образуются на чужеродные антигены (гемагглютинины, гемолизины, лейкотоксины, цитотоксины), имеют важное значение в формировании трансплантационного иммунитета. Они запускают антителоопосредованный цитолиз трансплантата (комплемент-опосредованный и антителозависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность).
Возможен адоптивный перенос трансплантационного иммунитета с помощью активированных лимфоцитов или со специфической антисывороткой от сенсибилизированной особи интактному макроорганизму.
Механизм иммунного отторжения пересаженных клеток и тканей имеет две фазы. В первой фазе вокруг трансплантата и сосудов наблюдается скопление иммунокомпетентных клеток (лимфоидная инфильтрация), в том числе Т-киллеров. Во второй фазе происходит деструкция клеток трансплантата Т-киллерами, активируются макрофагальное звено, естественные киллеры, специфический антителогенез. Возникает иммунное воспаление, тромбоз кровеносных сосудов, нарушается питание трансплантата и происходит его гибель. Разрушенные ткани утилизируются фагоцитами.
В процессе реакции отторжения формируется клон Т- и В-клеток иммунной памяти. Повторная попытка пересадки тех же органов и тканей вызывает вторичный иммунный ответ, который протекает очень бурно и быстро заканчивается отторжением трансплантата.
С клинической точки зрения выделяют острое, сверхострое и отсроченное отторжение трансплантата. Различаются они по времени реализации реакции и отдельным механизмам.
84. Серологический метод диагностики инфекционных болезней.
Иммунные реакции используют при диагностических и иммунологических исследованиях у больных и здоровых людей. С этой целью применяют серологические методы, т. е. методы изучения антител и антигенов с помощью реакций антиген—антитело, определяемых в сыворотке крови и других жидкостях, а также тканях организма.
Обнаружение в сыворотке крови больного антител против антигенов возбудителя позволяет поставить диагноз болезни. Серологические исследования применяют также для идентификации антигенов микробов, различных биологически активных веществ, групп крови, тканевых и опухолевых антигенов, иммунных комплексов, рецепторов клеток и др.
При выделении микроба от больного проводят идентификацию возбудителя путем изучения его антигенных свойств с помощью иммунных диагностических сывороток, т. е. сывороток крови гипериммунизированных животных, содержащих специфические антитела. Это так называемая серологическая идентификация микроорганизмов.
В микробиологии и иммунологии широко применяются реакции агглютинации, преципитации, нейтрализации, реакции с участием комплемента, с использованием меченых антител и антигенов (радиоиммунологический, иммуноферментный, иммунофлюоресцентный методы). Перечисленные реакции различаются по регистрируемому эффекту и технике постановки, однако, все они основаны на реакции взаимодействия антигена с антителом и применяются для выявления как антител, так и антигенов. Реакции иммунитета характеризуются высокой чувствительностью и специфичностью.
Особенности взаимодействия антитела с антигеном являются основой диагностических реакций в лабораториях. Реакция in vitro между антигеном и антителом состоит из специфической и неспецифической фазы. В специфическую фазу происходит быстрое специфическое связывание активного центра антитела с детерминантой антигена. Затем наступает неспецифическая фаза — более медленная, которая проявляется видимыми физическими явлениями, например образованием хлопьев (феномен агглютинации) или преципитата в виде помутнения. Эта фаза требует наличия определенных условий (электролитов, оптимального рН среды).
Связывание детерминанты антигена (эпитопа) с активным центром Fab-фрагмента антител обусловлено ван-дер-ваальсовыми силами, водородными связями и гидрофобным взаимодействием. Прочность и количество связавшегося антигена антителами зависят от аффинности, авидности антител и их валентности.
85. Реакция агглютинации и ее практическое применение.
Реакция агглютинации — простая по постановке реакция, при которой происходит связывание антителами корпускулярных антигенов (бактерий, эритроцитов или других клеток, нерастворимых частиц с адсорбированными на них антигенами, а также макромолекулярных агрегатов). Она протекает при наличии электролитов, например при добавлении изотонического раствора натрия хлорида.
Применяются различные варианты реакции агглютинации: развернутая, ориентировочная, непрямая и др. Реакция агглютинации проявляется образованием хлопьев или осадка (клетки, «склеенные» антителами, име ющими два или более антигенсвязывающих центра — рис. 13.1). РА используют для:
1) определения антител в сыворотке крови больных, например, при бруцеллезе (реакции Райта, Хеддельсона), брюшном тифе и паратифах (реакция Видаля) и других инфекционных болезнях;
2) определения возбудителя, выделенного от больного;
3) определения групп крови с использованием моноклональных антител против алло-антигенов эритроцитов.
Для определения у больного антител ставят развернутую реакцию агглютинации: к разведениям сыворотки крови больного добавляют диагностикум (взвесь убитых микробов,) и через несколько часов инкубации при 37 ˚С отмечают наибольшее разведение сыворотки (титр сыворотки), при котором произошла агглютинация, т. е. образовался осадок.
Характер и скорость агглютинации зависят от вида антигена и антител. Примером являются особенности взаимодействия диагностикумов (О- и H-антигенов) со специфическими антителами. Реакция агглютинации с О-диагностикумом (бактерии, убитые нагреванием, сохранившие термостабильный О-антиген) происходит в виде мелкозернистой агглютинации. Реакция агглютинации с Н-диагностикумом (бактерии, убитые формалином, сохранившие термолабильный жгутиковый Н-антиген) — крупнохлопчатая и протекает быстрее.
Если необходимо определить возбудитель, выделенный от больного, ставят ориентировочную реакцию агглютинации, применяя диагностические антитела (агглютинирующую сыворотку), т. е. проводят серотипирование возбудителя. Ориентировочную реакцию проводят на предметном стекле. К капле диагностической агглютинирующей сыворотки в разведении 1:10 или 1:20 добавляют чистую культуру возбудителя, выделенного от больного. Рядом ставят контроль: вместо сыворотки наносят каплю раствора натрия хлорида. При появлении в капле с сывороткой и микробами хлопьевидного осадка ставят развернутую реакцию агглютинации в пробирках с увеличивающимися разведениями агглютинирующей сыворотки, к которым добавляют по 2—3 капли взвеси возбудителя. Агглютинацию учитывают по количеству осадка и степени просветления жидкости. Реакцию считают положительной, если агглютинация отмечается в разведении, близком к титру диагностической сыворотки. Одновременно учитывают контроли: сыворотка, разведенная изотоническим раствором натрия хлорида, должна быть прозрачной, взвесь микробов в том же растворе — равномерно мутной, без осадка.
Разные родственные бактерии могут агглютинироваться одной и той же диагностической агглютинирующей сывороткой, что затрудняет их идентификацию. Поэтому пользуются адсорбированными агглютинирующими сыворотками, из которых удалены перекрестно реагирующие антитела путем адсорбции их родственными бактериями. В таких сыворотках сохраняются антитела, специфичные только к данной бактерии.
Реакцию агглютинации для определения антирезусных антител (непрямую реакцию Кумбса) применяют у больных при внутрисосудистом гемолизе. У некоторых таких больных обнаруживают антирезусные антитела, которые являются неполными, одновалентными. Они специфически взаимодействуют с резус-положительными эритроцитами, но не вызывают их агглютинации. Наличие таких неполных антител определяют в непрямой реакции Кумбса. Для этого в систему антирезусные антитела + резус-положительные эритроциты добавляют антиглобулиновую сыворотку (антитела против иммуноглобулинов человека), что вызывает агглютинацию эритроцитов. С помощью реакции Кумбса диагностируют патологические состояния, связанные с внутрисосудистым лизисом эритроцитов иммунного генеза, например гемолитическую болезнь новорожденных: эритроциты резус-положительного плода соединяются с циркулирующими в крови неполными антителами к резус-фактору, которые перешли через плаценту от резус-отрицательной матери.
Механизм. Сложность выявления неполных (моновалентных) антител связана с тем, что эти антитела, связываясь с эпитопами специфического антигена, не образуют структуру решетки и реакция между антигенами и антителами не выявляется ни агглютинацией, ни преципитацией, ни другими тестами. Для выявления образовавшихся комплексов антиген — антитело приходится использовать дополнительные тест-системы. Для выявления неполных антител, например к резус-антигену эритроцитов в сыворотке крови беременной женщины, реакция ставится в два этапа: 1) к двукратным разведениям испытуемой сыворотки добавляют эритроциты, содержащие резус-антиген, и выдерживают при 37 °С в течение часа; 2) к тщательно отмытым после первого этапа эритроцитам добавляют кроличью античеловеческую анти-глобулиновую сыворотку (в заранее оттитрованном рабочем разведении). После инкубации в течение 30 мин при 37 °С результаты оценивают по наличию гемагглютинации (положительная реакция). Необходимо ставить контроль ингредиентов реакции: 1) антиглобулиновая сыворотка + заведомо сенсибилизированные специфическими антителами эритроциты; 2) обработанные нормальной сывороткой эритроциты + антиглобулиновая сыворотка; 3) обработанные исследуемой сывороткой резус-отрицательные эритроциты + антиглобулиновая сыворотка.
87. Реакция пассивной гемагглютинации и ее практическое применение.
Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации (РНГА, РПГА) основана на использовании эритроцитов (или латекса) с адсорбированными на их поверхности антигенами или антителами, взаимодействие которых с соответствующими антителами или антигенами сыворотки крови больных вызывает склеивание и выпадение эритроцитов на дно пробирки или ячейки в виде фестончатого осадка.
Компоненты. Для постановки РНГА могут быть использованы эритроциты барана, лошади, кролика, курицы, мыши, человека и другие, которые заготавливают впрок, обрабатывая формалином или глютаральдегидом. Адсорбционная емкость эритроцитов увеличивается при обработке их растворами танина или хлорида хрома.
Антигенами в РНГА могут служить полисахаридные АГ микроорганизмов, экстракты бактериальных вакцин, АГ вирусов и риккетсий, а также другие вещества.
Эритроциты, сенсибилизированные АГ, называются эритроцитарными диагностикумами. Для приготовления эритроцитарного диагностикума чаще всего используют эритроциты барана, обладающие высокой адсорбирующей активностью.
Применение. РНГА применяют для диагностики инфекционных болезней, определения гонадотропного гормона в моче при установлении беременности, для выявления повышенной чувствительности к лекарственным препаратам, гормонам и в некоторых других случаях.
Механизм. Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА) отличается значительно более высокой чувствительностью и специфичностью, чем реакция агглютинации. Ее используют для идентификации возбудителя по его антигенной структуре или для индикации и идентификации бактериальных продуктов — токсинов в исследуемом патологическом материале. Соответственно используют стандартные (коммерческие) эритроцитарные антительные диагностикумы, полученные путем адсорбции специфических антител на поверхности танизированных (обработанных танином) эритроцитов. В лунках пластмассовых пластин готовят последовательные разведения исследуемого материала. Затем в каждую лунку вносят одинаковый объем 3 % суспензии нагруженных антителами эритроцитов. При необходимости реакцию ставят параллельно в нескольких рядах лунок с эритроцитами, нагруженными антителами разной групповой специфичности.
Через 2 ч инкубации при 37 °С учитывают результаты, оценивая внешний вид осадка эритроцитов (без встряхивания): при отрицательной реакции появляется осадок в виде компактного.диска или кольца на дне лунки, при положительной реакции — характерный кружевной осадок эритроцитов, тонкая пленка с неровными краями.
88. Реакция преципитации и ее практическое применение.
Реакция преципитации (РП) - это формирование и осаждение комплекса растворимого молекулярного антигена с антителами в виде помутнения, называемого преципитатом. Он образуется при смешивании антигенов и антител в эквивалентных количествах; избыток одного из них снижает уровень образования иммунного комплекса.
РП ставят в пробирках (реакция кольцепреципитации), в гелях, питательных средах и др. Широкое распространение получили разновидности РП в полужидком геле агара или агарозы: двойная иммунодиффузия по Оухтерлони, радиальная иммунодиффузия, иммуноэлектрофорез и др.
Механизм. Проводится с прозрачными коллоидными растворимыми антигенами, экстрагированными из патологического материала, объектов внешней среды или чистых культур бактерий. В реакции используют прозрачные диагностические преципитирующие сыворотки с высокими титрами антител. За титр преципитирующей сыворотки принимают то наибольшее разведение антигена, которое при взаимодействии с иммунной сывороткой вызывает образование видимого преципитата — помутнение.
Реакция кольцепреципитации ставится в узких пробирках (диаметр 0,5 см), в которые вносят по 0,2—0,3 мл преципити-рующей сыворотки. Затем пастеровской пипеткой медленно наслаивают 0,1—0,2 мл раствора антигена. Пробирки осторожно переводят в'вертикальное положение. Учет реакции производят через 1—2 мин. В случае положительной реакции на границе между сывороткой и исследуемым антигеном появляется преципитат в виде белого кольца. В контрольных пробирках преципитат не образуется.
89. Реакция связывания комплемента и ее практическое применение.
Реакция связывания комплемента (РСК) заключается в том, что при соответствии друг другу антигены и антитела образуют иммунный комплекс, к которому через Fc-фрагмент антител присоединяется комплемент (С), т. е. происходит связывание комплемента комплексом антиген—антитело. Если же комплекс антиген—антитело не образуется, то комплемент остается свободным.
Специфическое взаимодействие АГ и AT сопровождается адсорбцией (связыванием) комплемента. Поскольку процесс связывания комплемента не проявляется визуально, Ж. Борде и О.Жангу предложили использовать в качестве индикатора гемолитическую систему (эритроциты барана + гемолитическая сыворотка), которая показывает, фиксирован ли комплемент комплексом АГ-АТ. Если АГ и AT соответствуют друг другу, т. е. образовался иммунный комплекс, то комплемент связывается этим комплексом и гемолиза не происходит. Если AT не соответствует АГ, то комплекс не образуется и комплемент, оставаясь свободным, соединяется со второй системой и вызывает гемолиз.
Компоненты. Реакция связывания комплемента (РСК) относится к сложным серологическим реакциям. Для ее проведения необходимы 5 ингредиентов, а именно: АГ, AT и комплемент (первая система), эритроциты барана и гемолитическая сыворотка (вторая система).
Антигеном для РСК могут быть культуры различных убитых микроорганизмов, их лизаты, компоненты бактерий, патологически измененных и нормальных органов, тканевых липидов, вирусы и вирусосодержащие материалы.
В качестве комплемента используют свежую или сухую сыворотку морской свинки.
Механизм. РСК проводят в две фазы: 1-я фаза — инкубация смеси, содержащей три компонента антиген + антитело + комплемент; 2-я фаза (индикаторная) — выявление в смеси свободного комплемента путем добавления к ней гемолитической системы, состоящей из эритроцитов барана, и гемолитической сыворотки, содержащей антитела к ним. В 1-й фазе реакции при образовании комплекса антиген—антитело происходит связывание им комплемента, и тогда во 2-й фазе гемолиз сенсибилизированных антителами эритроцитов не произойдет; реакция положительная. Если антиген и антитело не соответствуют друг другу (в исследуемом образце нет антигена или антитела), комплемент остается свободным и во 2-й фазе присоединится к комплексу эритроцит — ан-тиэритроцитарное антитело, вызывая гемолиз; реакция отрицательная.
Применение. РСК применяют для диагностики многих инфекционных болезней, в частности сифилиса (реакция Вассермана).
90. Реакция нейтрализации токсина антитоксином и ее практическое применение.
В основе этой реакции лежит способность специфической антитоксической сыворотки нейтрализовать экзотоксин.
Антитела иммунной сыворотки способны нейтрализовать повреждающее действие микробов или их токсинов на чувствительные клетки и ткани, что связано с блокадой микробных антигенов антителами, т. е. их нейтрализацией.
Реакцию нейтрализации (РН) проводят путем введения смеси антиген—антитело животным или в чувствительные тест-объекты (культуру клеток, эмбрионы). При отсутствии у животных и тест-объектов повреждающего действия микроорганизмов или их антигенов, токсинов говорят о нейтрализующем действии иммунной сыворотки и, следовательно, о специфичности взаимодействия комплекса антиген—антитело.
Для проведения реакции исследуемый материал, в котором предполагается наличие экзотоксина, смешивают с антитоксической сывороткой, выдерживают в термостате и вводят животным (морским свинкам, мышам). Контрольным животным вводят фильтрат исследуемого материала, не обработанный сывороткой. В том случае, если произойдет нейтрализация экзотоксина антитоксической сывороткой, животные опытной группы останутся живыми. Контрольные животные погибнут в результате действия экзотоксина.
91. Реакция иммунофлюоресценции и ее практическое применение.
Иммунофлюоресцентный метод (РИФ, реакция иммунофлюоресценции, реакция Кунса) - метод выявления специфических Аг с помощью Ат, конъюгированных с флюорохромом. Обладает высокой чувствительностью и специфичностью.
Применяется для экспресс-диагностики инфекционных заболеваний (идентификация возбудителя в исследуемом материале), а также для определения Ат и поверхностных рецепторов и маркеров лейкоцитов (иммунофенотипирование) и др. клеток.
Обнаружение бактериальных и вирусных антигенов в инфекционных материалах, тканях животных и культурах клеток при помощи флюоресцирующих антител (сывороток) получило широкое применение в диагностической практике. Приготовление флюоресцирующих сывороток основано на способности некоторых флюорохромов (например, изотиоцианата флюоресцеина) вступать в химическую связь с сывороточными белками, не нарушая их иммунологической специфичности.
Различают три разновидности метода: прямой, непрямой, с комплементом. Прямой метод РИФ основан на том, что антигены тканей или микробы, обработанные иммунными сыворотками с антителами, меченными флюорохромами, способны светиться в УФ-лучах люминесцентного микроскопа. Бактерии в мазке, обработанные такой люминесцирующей сывороткой, светятся по периферии клетки в виде каймы зеленого цвета.
Непрямой метод РИФ заключается в выявлении комплекса антиген - антитело с помощью антиглобулиновой (против антитела) сыворотки, меченной флюорохромом. Для этого мазки из взвеси микробов обрабатывают антителами антимикробной кроличьей диагностической сыворотки. Затем антитела, не связавшиеся антигенами микробов, отмывают, а оставшиеся на микробах антитела выявляют, обрабатывая мазок антиглобулиновой (антикроличьей) сывороткой, меченной флюорохромами. В результате образуется комплекс микроб + антимикробные кроличьи антитела + антикроличьи антитела, меченные флюорохромом. Этот комплекс наблюдают в люминесцентном микроскопе, как и при прямом методе.
Механизм. На предметном стекле готовят мазок из исследуемого материала, фиксируют на пламени и обрабатывают иммунной кроличьей сывороткой, содержащей антитела против антигенов возбудителя. Для образования комплекса антиген — антитело препарат помещают во влажную камеру и инкубируют при 37 °С в течение 15 мин, после чего тщательно промывают изотоническим раствором хлорида натрия для удаления не связавшихся с антигеном антител. Затем на препарат наносят флюоресцирующую антиглобулиновую сыворотку против глобулинов кролика, выдерживают в течение 15 мин при 37 °С, а затем препарат тщательно промывают изотоническим раствором хлорида натрия. В результате связывания флюоресцирующей антиглобулиновой сыворотки с фиксированными на антигене специфическими анти телами образуются светящиеся комплексы антиген — антитело, которые обнаруживаются при люминесцентной микроскопии.
Иммуноферментный анализ или метод — выявление антигенов с помощью соответствующих им антител, конъюгированных с ферментом-меткой (пероксидазой хрена, бета-галактозидазой или щелочной фосфатазой). После соединения антигена с меченной ферментом иммунной сывороткой в смесь добавляют субстрат/хромоген. Субстрат расщепляется ферментом и изменяется цвет продукта реакции — интенсивность окраски прямо пропорциональна количеству связавшихся молекул антигена и антител. ИФА применяют для диагностики вирусных, бактериальных и паразитарных болезней, в частности для диагностики ВИЧ-инфекций, гепатита В и др., а также определения гормонов, ферментов, лекарственных препаратов и других биологически активных веществ, содержащихся в исследуемом материале в минорных концентрациях (1010-1012 г/л).
Твердофазный ИФА — вариант теста, когда один из компонентов иммунной реакции (антиген или антитело) сорбирован на твердом носителе, напр., в лунках планшеток из полистирола. Компоненты выявляют добавлением меченых антител или антигенов. При положительном результате изменяется цвет хромогена. Каждый раз после добавления очередного компонента из лунок удаляют несвязавшиеся реагенты путем промывания,
I. При определении антител (левый рисунок) в лунки планшеток с сорбированным антигеном последовательно добавляют сыворотку крови больного, антиглобулиновую сыворотку, меченную ферментом, и субстрат/хромоген для фермента.
II. При определении антигена (правый рисунок) в лунки с сорбированными антителами вносят антиген (напр., сыворотку крови с искомым антигеном), добавляют диагностическую сыворотку против него и вторичные антитела (против диагностической сыворотки), меченные ферментом, а затем субстрат/хромоген для фермента.
Конкурентный ИФА для определения антигенов: искомый антиген и меченный ферментом антиген конкурируют друг с другом за связывание ограниченного количества антител иммунной сыворотки.
Другой тест - Конкурентный ИФА для определения антител: искомые антитела и меченные ферментом антитела конкурируют друг с другом за антигены, сорбированные на твердой фазе.
Иммуноблоттинг — высокочувствительный метод выявления белков, основанный на сочетании электрофореза и ИФА или РИА. Иммуноблоттинг используют как диагностический метод при ВИЧ-инфекции и др.
Антигены возбудителя разделяют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле, затем переносят их из геля на активированную бумагу или нитроцеллюлозную мембрану и проявляют с помощью ИФА. Фирмы выпускают такие полоски с «блотами» антигенов. На эти полоски наносят сыворотку больного. Затем, после инкубации, отмывают от несвязавшихся антител больного и наносят сыворотку против иммуноглобулинов человека, меченную ферментом. Образовавшийся на полоске комплекс [антиген + антитело больного + антитело против Ig человека] выявляют добавлением хромогенного субстрата, изменяющего окраску под действием фермента.
Вакцина — медицинский препарат, предназначенный для создания иммунитета к инфекционным болезням.
Классификации вакцин:
1.Живые вакцины - препараты, действующим началом в которых являются ослабленные тем или иным способом, потерявшие свою вирулентность, но сохранившие специфическую антигенность штаммы патогенных бактерий. Примером таких вакцин являются БЦЖ и вакцина против натуральной оспы человека, в качестве которой используется непатогенный для человека вирус оспы коров.
2.Инактивированные (убитые) вакцины – препараты, в качестве действующего начала включающие убитые химическим или физическим способом культуры патогенных вирусов или бактерий, (клеточные, вирионные) или же извлечённые из патогенных микробов комплексы антигенов, содержащие в своём составе проективные антигены (субклеточные, субвирионные вакцины). В препараты иногда добавляют консерванты и адьюванты.
Молекулярные вакцины – в них антиген находится в молекулярной форме или даже в виде фрагментов его молекул, определяющих специфичность т. е. в виде эпитопов, детерминант.
Корпускулярные вакцины – содержащие в своем составе протективный антиген
3.Анатоксины относятся к числу наиболее эффективных препаратов. Принцип получения – токсин соответствующей бактерии в молекулярном виде превращают в нетоксичную, но сохранившую свою антигенную специфичность форму путем воздействия 0.4% формальдегида при 37t в течение 3-4 недель, далее анатоксин концентрируют, очищают, добавляют адьюванты.
4.Синтетические вакцины. Молекулы эпитопов сами по себе не обладают высокой иммуногенностью для повышения их антигенных свойств эти молекулы сшиваются с полимерным крупномолекулярным безвредным веществом, иногда добавляют адьюванты.
5.Ассоциированные вакцины – препараты, включающие несколько разнородных антигенов.
Требования, предъявляемые к современным вакцинам:
Иммуногенность;
Низкая реактогенность (аллергенность);
Не должны обладать тератогенностью, онкогенностью;
Штаммы, из которых приготовлена вакцина, должны быть генетически стабильны;
Длительный срок хранения;
Технологичность производства;
Простота и доступность в применении
94. Живые вакцины, получение, применение.
Живые вакцины - препараты, действующим началом в которых являются ослабленные тем или иным способом, потерявшие свою вирулентность, но сохранившие специфическую антигенность штаммы патогенных бактерий.
Аттенуация (ослабление) возможна путём воздействия на штамм химических (мутагены) и физических (температура) факторов или посредством длительных пассажей через невосприимчивый организм. Так же в качестве живых вакцин используются дивергентные штаммы (непатогенные для человека), имеющие общие протективные антигены с патогенными для человека микробами. Примером такой вакцины является БЦЖ и вакцина против натуральной оспы.
Возможно получение живых вакцин генно-инженерным способом. Принцип получения таких вакцин сводится к созданию непатогенных для человека рекмбинантных штаммов, несущих протективные антигены патогенных микробов и способных при введении в орг. человека размножаться и создавать иммунитет. Такие вакцины называют векторными.
Вне зависимости от того, какие штаммы включены в вакцины, бактерии получают путём выращивания на искусственных питательных средах, культурах клеток или куриных эмбрионах. В живую вакцину, как правило, добавляют стабилизатор, после чего подвергают лиофильному высушиванию.
В связи с тем, что живые вакцины способны вызывать вакцинную инфекцию (живые аттенуированные микробы размножаются в организме, вызывая воспалительный процесс проходящий без клинических проявлений), они всегда вызывают перестройку иммунобиологического статуса организма и образование специфических антител. Это так же может являться недостатком, т. к. живые вакцины чаще вызывают аллергические реакции.
Вакцины данного типа, как правило, вводятся однократно.
Примеры: сибиреязвенная вакцина, чумная вакцина, бруцеллёзная вакцина, БЦЖ вакцина, оспенная дермальная вакцина.
Инактивированные (убитые, корпускулярные или молекулярные) вакцины – препараты, в качестве действующего начала включающие убитые химическим или физическим способом культуры патогенных вирусов или бактерий, (клеточные, вирионные) или же извлечённые из патогенных микробов комплексы антигенов, содержащие в своём составе проективные антигены (субклеточные, субвирионные вакцины).
Для выделения из бактерий и вирусов антигенных комплексов (гликопротеинов, ЛПС, белков) применяют трихлоруксусную кислоту, фенол, ферменты, изоэлектрическое осаждение.
Их получают путем выращивания патогенных бактерий и вирусов на искусственных питательных средах, инактивируют, выделяют антигенные комплексы, очищают, конструируют в виде жидкого или лиофильного препарата.
Преимуществом данного типа вакцин является относительная простота получения (не требуется длительного изучения и выделения штаммов). К недостаткам же относятся низкая иммуногенность, потребность в трехкратном применении и высокая реактогенность формализированных вакцин. Так же, по сравнению с живыми вакцинами, иммунитет, вызываемый ими, непродолжителен.
В настоящее время применяются следующие убитые вакцины: брюшнотифозная, обогащенная Vi антигеном; холерная вакцина, коклюшная вакцина
Генно-инженерные вакцины – это препараты, полученные с помощью биотехнологии, которая по сути сводиться к генетической рекомбинации .
Для начала получают ген, который должен быть встроен в геном реципиента. Небольшие гены могут быть получены методом химического синтеза. Для этого расшифровывается число и последовательность аминокислот в белковой молекуле вещества, затем по этим данным узнают очерёдность нуклеотидов в гене, далее следует синтез гена химическим путем.
Крупные структуры, которые довольно сложно синтезировать получаются путем выделения(клонирования), прицельного выщепления этих генетических образований с помощью рестриктаз.
Полученный одним из способов целевой ген с помощью ферментов сшивается с другим геном, который используется в качестве вектора для встраивания гибридного гена в клетку. Вектором могут служить плазмиды, бактериофаги, вирусы человека и животных. Экспрессируемый ген встраивается в бактериальную или животную клетку, которая начинает синтезировать несвойственное ей ранее вещество, кодируемое эксперссируемым геном.
В качестве реципиентов экспрессируемого гена чаще всего используется E. coli, B. subtilis, псевдомонады, дрожжи, вирусы. некоторые штаммы способны переключаться на синтез чужеродного вещества до 50% своих синтетических возможностей – эти штамм называются суперпродуцентами.
Иногда к генно-инженерным вакцинам добавляется адъювант.
Примерами таких вакцин служат вакцина против гепатита В (энджерикс), сифилиса, холеры, бруцеллёза, гриппа, бешенства.
Есть определённые сложности в разработке и применении:
- длительное время к генно-инженерным препаратам относились настороженно.
- на разработку технологии для получения вакцины затрачиваются значительные средства
- при получении препаратов данным способом возникает вопрос об идентичности полученного материала природному веществу.
Ассоциированные вакцины – препараты, включающие несколько разнородных антигенов и позволяющие проводить иммунизацию против нескольких инфекций одновременно. Если в препарат входят однородные антигены, то такую ассоциированную вакцину называют поливакциной. Если же ассоциированный препарат состоит из разнородных антигенов, то его целесообразно называть комбинированной вакциной.
Возможна так же комбинированная иммунизация, когда одновременно вводят несколько вакцин в различные участки тела, например, против оспы(накожно) и чумы(подкожно)
Примером поливакцины можно считать живую полиомиелитную поливакцину, содержащую аттенуированные штаммы вируса полиомиелита I, II, III типов. Примером комбинированной вакцины является АКДС, куда входят инактивированная корпускулярная коклюшная вакцина, дифтерийный и столбнячный анатоксин.
Комбинированные вакцины применяются в сложной противоэпидемической обстановке. В основе их действия лежит способность иммунной системы отвечать на несколько антигенов одновременно
Анатоксины – препараты, полученные из бактериальных экзотоксинов, полностью лишенные своих токсических свойств, но сохранившие антигенные и иммуногенные свойства. Получение: токсигенные бактерии выращивают на жидких средах, фильтруют с помощью бактериальных фильтров для удаления микробных тел, к фильтрату добавляют 0,4% формалина и выдерживают в термостате при 30-40t на 4 недели до полного исчезновения токсических свойств, проверяют на стерильность, токсигенность и иммуногенность. Эти препараты называются нативными анатоксинам, в настоящее время почти не используются, т. к. содержат большое количество балластных веществ, неблагоприятно влияющих на организм. Анатоксины подвергаю физической и химической очистке, адсорбируют на адъювантах. Такие препараты называются адсорбированными высокоочищенными концентрированными анатоксинами.
Титрование анатоксинов в реакции фолликуляции производят по стандартной фолликулирующей атитоксической сыворотке, в которой известно количество антитоксических единиц. 1 антигенная единица анатоксина обозначается Lf, это то количество анатоксина, которое вступает в реакцию фолликуляции с 1 единицей дифтерийного анатоксина.
Анатоксины применяются для профилактики и реже, для лечения токсинемических инфекций дифтерия, газовая гангрена, ботулизм, столбняк). Так же анатоксины применяются для получения антитоксических сывороток путем гипериммунизации животных.
Примеры препаратов: АКДС, АДС, адсорбированный стафилококковый анатоксин, ботулинистический анатоксин, анатоксины из экзотоксинов возбудителей газовых инфекций.
Иммунные сыворотки: иммунологические препараты на основе антител.
1.Антитоксические - сыворотки против дифтерии, столбняка, ботулизма, газовой гангрены, т.е. сыворотки, содержащие в качестве антител антитоксины, которые нейтрализуют специфические токсины.
2.Антибактериальные - сыворотки, содержащие агглютинины, преципитины, комплементсвязывающие антитела к возбудителям брюшного тифа, дизентерии, чумы, коклюша.
3.Противовирусные сыворотки (коревая, гриппозная, антирабическая) содержат вируснейтрализующие, комплементсвязывающие противовирусные антитела.
Иммунные сыворотки получают путем гипериммунизации животных (лошади) специфическим антигеном (анатоксином, бактериальными или вирусными культурами и их антигенами) с последующим, в период максимального антителообразования, выделением из крови иммунной сыворотки. Иммунные сыворотки, полученные от животных, называют гетерогенными, так как они содержат чужеродные для человека сывороточные белки.
Для получения гомологичных нечужеродных иммунных сывороток используют сыворотки переболевших людей (коревая, оспенная сыворотки) или специально иммунизированных людей-доноров (противостолбнячная, противоботулиническая), содержащие антитела к ряду возбудителей инфекционных болезней вследствие вакцинации или перенесенного заболевания.
Нативные иммунные сыворотки содержат ненужные белки (альбумин), из этих сывороток выделяют и подвергают очистке специфические белки- иммуноглобулины. Методы очистки: осаждение спиртом, ацетоном на холоде, обработка ферментами.
Иммунные сыворотки создают пассивный специфический иммунитет сразу после введения. Применяют с лечебной и профилактической целью. Для лечения токсинемических инфекций (столбняк, ботулизм, дифтерия, газовая гангрена), а также для лечения бактериальных и вирусных инфекций (корь, краснуха, чума, сибирская язва). С лечебной целью сывороточные препараты в/м. Профилактически: в/м лицам, имевшим контакт с больным, для создания пассивного иммунитета.
Антитоксические гетерогенные сыворотки получаются путем гипериммунизации различных животных. Они называются гетерогенными т.к. содержат чужеродные для человека сывороточные белки. Более предпочтительным является применение гомологичных антитоксических сывороток, для получения которых используется сыворотка переболевших людей (коревая, паротидная), или специально иммунизированных доноров(противостолбнячная, противоботулинистическая), сыворотка из плацентарной а так же абортивной крови, содержащие антитела к ряду возбудителей инфекционных болезней вследствие вакцинации или перенесенного заболевания.
Для очистки и концентрирования антитоксических сывороток используют методы: осаждение спиртом или ацетоном на холоде, обработка ферментами, аффинная хроматография, ультрафильтрация.
Активность иммунных антитоксических сывороток выражают в антитоксических единицах, т.е. тем наименьшим кол-вом антител, которое вызывает видимую или регистрируемую соответствующим способом реакцию с определённым кол-вом специфического антигена. активность антитоксической противостолбнячной сыворотки и соответствующего Ig выражается в антитоксических единицах.
Антитоксические сыворотки применяются для лечения токсинемических инфекций (столбняк, ботулизм, дифтерия, газовая гангрена).
После введения антитоксических сывороток возможны осложнения в виде анафилактического шока и сывороточной болезни, поэтому пред введением препаратов ставят аллергическую пробу на чувствительность к ним пациента, а вводят их дробно, по Безредке.
Нативные иммунные сыворотки содержат ненужные белки (альбумин), из этих сывороток выделяют и подвергают очистке специфические белки- иммуноглобулины.
Иммуноглобулины, иммунные сыворотки подразделяют на:
1.Антитоксические - сыворотки против дифтерии, столбняка, ботулизма, газовой гангрены, т.е. сыворотки, содержащие в качестве антител антитоксины, которые нейтрализуют специфические токсины.
2.Антибактериальные - сыворотки, содержащие агглютинины, преципитины, комплементсвязывающие антитела к возбудителям брюшного тифа, дизентерии, чумы, коклюша.
3.Противовирусные сыворотки (коревая, гриппозная, антирабическая) содержат вируснейтрализующие, комплементсвязывающие противовирусные антитела.
Методы очистки: осаждение спиртом, ацетоном на холоде, обработка ферментами, аффинная хроматография, ультрафильтрация.
Активность иммуноглобулинов выражают в антитоксических единицах, в титрах вируснейтрализующей, гемагглютинирующей, агглютинирующей активности, т.е. тем наименьшим количеством антител, которое вызывает видимую реакцию с определенным количеством специфического антигена.
Иммуноглобулины создают пассивный специфический иммунитет сразу после введения. Применяют с лечебной и профилактической целью. Для лечения токсинемических инфекций (столбняк, ботулизм, дифтерия, газовая гангрена), а также для лечения бактериальных и вирусных инфекций (корь, краснуха, чума, сибирская язва). С лечебной целью сывороточные препараты в/м. Профилактически: в/м лицам, имевшим контакт с больным, для создания пассивного иммунитета.
При необходимости экстренного создания иммунитета, для лечения развивающейся инфекции применяют иммуноглобулины, содержащие готовые антитела.
100. Иммунобиологические препараты, содержащие антитела. Применение для диагностики инфекционных заболеваний.
Иммунные сыворотки: иммунологические препараты на основе антител.
1.Антитоксические - сыворотки против дифтерии, столбняка, ботулизма, газовой гангрены, т.е. сыворотки, содержащие в качестве антител антитоксины, которые нейтрализуют специфические токсины.
2.Антибактериальные - сыворотки, содержащие агглютинины, преципитины, комплементсвязывающие антитела к возбудителям брюшного тифа, дизентерии, чумы, коклюша.
3.Противовирусные сыворотки (коревая, гриппозная, антирабическая) содержат вируснейтрализующие, комплементсвязывающие противовирусные антитела.
Иммунные сыворотки получают путем гипериммунизации животных (лошади) специфическим антигеном (анатоксином, бактериальными или вирусными культурами и их антигенами) с последующим, в период максимального антителообразования, выделением из крови иммунной сыворотки. Иммунные сыворотки, полученные от животных, называют гетерогенными, так как они содержат чужеродные для человека сывороточные белки.
Для получения гомологичных нечужеродных иммунных сывороток используют сыворотки переболевших людей (коревая, оспенная сыворотки) или специально иммунизированных людей-доноров (противостолбнячная, противоботулиническая), содержащие антитела к ряду возбудителей инфекционных болезней вследствие вакцинации или перенесенного заболевания.
Нативные иммунные сыворотки содержат ненужные белки (альбумин), из этих сывороток выделяют и подвергают очистке специфические белки- иммуноглобулины. Методы очистки: осаждение спиртом, ацетоном на холоде, обработка ферментами.
Иммунные сыворотки создают пассивный специфический иммунитет сразу после введения. Применяют с лечебной и профилактической целью. Для лечения токсинемических инфекций (столбняк, ботулизм, дифтерия, газовая гангрена), а также для лечения бактериальных и вирусных инфекций (корь, краснуха, чума, сибирская язва). С лечебной целью сывороточные препараты в/м. Профилактически: в/м лицам, имевшим контакт с больным, для создания пассивного иммунитета.
Вакцинопрофилактика инфекционных болезней в России проводится в рамках плановых прививок и прививок по эпидемическим показаниям.
Плановые прививки проводятся во всех регионах страны в соответствии с календарем профилактических прививок (вакцинация против гепатита В, туберкулеза, полиомиелита, коклюша, дифтерии, столбняка, гемофильной инфекции, кори, эпидемического паротита, краснухи – табл. 14). Проводятся также плановые прививки населению на территориях, эндемичных по природно-очаговым и зоонозным инфекциям, группам с высоким риском заражения.
Прививки по экстренным эпидемическим показаниям предусмотрены в случае контакта восприимчивых (непривитых) лиц с источником инфекции. Сюда относятся прививки против гриппа, менингококковой инфекции, особо опасных инфекций, прививки в очагах инфекции, а также экстренная профилактика столбняка, бешенства. Группы населения, подлежащие вакцинации при возникновении неблагоприятной эпидемической обстановки, определяют органы управления здравоохранения субъектов России.
Таблица 14. Календарь профилактических прививок России
Возраст |
Наименование прививки |
12 часов |
Первая вакцинация против гепатита В |
3-7 день |
Вакцинация против туберкулеза |
1 месяц |
Вторая вакцинация – против гепатита В |
3 месяца |
Первая вакцинация – против дифтерии, коклюша, столбняка, полиомиелита, гемофильной инфекции |
4,5 месяца |
Вторая вакцинация – против дифтерии, коклюша, столбняка, полиомиелита, гемофильной инфекции |
6 месяцев |
Третья вакцинация – против дифтерии, коклюша, столбняка, полиомиелита, гепатита В |
12 месяцев |
Вакцинация против кори, паротита, краснухи |
18 месяцев |
Первая ревакцинация – против дифтерии, коклюша, столбняка, полиомиелита, гемофильной инфекции |
20 месяцев |
Вторая ревакцинация - полиомиелит |
6 лет |
Вторая вакцинация против кори, паротита, краснухи |
7 лет |
Вторая ревакцинация против дифтерии, столбняка. Первая ревакцинация против туберкулеза |
13 лет |
Вакцинация против гепатита В. Вакцинация против краснухи (девочки) |
14 лет |
Третья ревакцинация против дифтерии, столбняка, ревакцинация против туберкулеза |
Взрослые |
Ревакцинация против дифтерии и столбняка каждые 10 лет от момента последней ревакцинации |
102. Аллергический метод диагностики инфекционных болезней.
Аллергены. В практике здравоохранения инфекционные и неинфекционные аллергены используют как для специфической диагностики заболеваний, так и для их специфической иммунотерапии. Аллергены применяют с целью выявления иммунологической перестройки организма в результате вакцинации или заболевания, а также для определения чувствительности больного к определенным лекарственным средствам. Основные требования к аллергенам — высокая чувствительность и специфичность. Микробные аллергены готовят из фильтратов бульонных культур (туберкулин, бруцеллин, гистоплазмин) или из клеток микроорганизмов аналогично химическим вакцинам. Их контролируют и хранят аналогично другим бактериальным препаратам.
Инфекционные аллергены представлены аллергенами грибов, условно-патогенных и патогенных микроорганизмов.
Аллергодиагностика инфекционных болезней основана на способности кожи человека, сенсибилизированного к аллергену определенного микроорганизма, реагировать на его внутрикожное введение развитием аллергической реакции. Аллергены наиболее часто вводят накожно (проба Пирке), внутрикожно (проба Манту) в объеме 0,1 мл в ладонную поверхность предплечья или методом укола - прик-тесты, а также провокационные тесты. При положительной реакции на месте нанесения аллергена наблюдается покраснение и припухлость. В последние годы в практику внедрены препараты для сухого прик-теста, представляющие собой металлические ланцеты с фиксированным на них сухим стандартизованным аллергеном. Все диагностические кожные аллергические реакции учитываются через 20 минут (реакция немедленного типа) и через 24-48 часов (реакция замедленного типа).
Диагностика аллергии может осуществляться также с помощью реакций in vitro (радиоаллергосорбентный, радиоиммунный тесты, иммуноблотинг, иммуноферментный анализ, реакция торможения миграции лейкоцитов - РТМЛ, тест ППН - показатель повреждения нейтрофилов).
Бактериальные аллергены, как правило, используются для диагностики, реже – для специфической иммунотерапии различных хронических и рецидивирующих инфекционно-аллергических заболеваний (инфекционно-аллергическая форма бронхиальной астмы, хроническая пневмония, хронические тонзиллит, отит, синусит, бронхоэктатическая болезнь, полиартриты, энтериты, гастриты и т.д.).
Бактериальные аллергены представляют собой белковые термостабильные фракции бульонных культур соответствующих видов микроорганизмов, полученные путем осаждения уксусной кислотой с последующим растворением осадка боратно-солевым буфером. Аллергены стандартизуются по белковому азоту. С целью диагностики бактериальные аллергены вводят внутрикожно. В практических целях наибольшую значимость имеет применение аллергенов с целью постановки кожных аллергических проб для диагностики туберкулеза, бруцеллеза, туляремии, сибирской язвы.
Грибковые аллергены представляют собой водно-солевые растворы гликопротеидов мицелия грибов. Стандартизуются эти препараты по белковому азоту и применяются в диагностических целях для постановки внутрикожных аллергических проб при кандидамикозах, плесневых и некоторых других микозах.
«Dendrit» - информационный портал для медицинских работников, студентов медицинских ВУЗов, исследователей и пациентов.
Ваш источник новостей и знаний о здоровье.