Рост и размножение бактерий

Кривая роста характеризует рост и размножение бактерий в определенных условиях среды. Кривую роста получают при изучении периодической культуры.

 Периодическая культура это популяция микроорганизмов которая развивается в ограниченном объеме среды без поступления питательны веществ.

1 фаза – начальная – бактерии растут но не размножаются

2 фаза – фаза lg роста – бактерии интенсивно размножаются

3 фаза – стационарная – размножение – равно смертности

4 фаза – отмирания - накапливаются продукты метаболизмы, истощается питательная среда, бактерии погибают.

Внешние факторы могут оказывать

• Бактериостатическое действие – подавлять размножение и рост бактерий
• Бактерицидное действие – вызывать гибель бактерий

Ферменты бактерий

 – Энзимы – специфические белки, которые катализируют химические реакции. Ферменты, вызывают перераспределение электронных плотностей и некоторую деформацию молекулы субстрата. Это приводит к ослаблению внутримолекулярных связей, снижается энергия активации и ускоряется реакция.

Классификация ферментов –

1. По типу катализируемой реакции – оксиредуктазы, лиазы, трасферазы, гидролазы и тд.
2. По локализации – эндоферменты – катализируют реакции внутри клетки. Экзоферменты – выделяются из бактериальной клетки, катализируют расщепление
3. Генетический контроль образования – конститутивные(в течении всего жизненного цикла, не влияет наличие субстрата), индуцибильные – они образуются в ответ на наличие субстрата
4. По субстрату – протеолитические – расщепляют белки, сахаролитические – расщепляют углеводы, липолитические – расщепляющие жиры.

Значение ферментов.

1. Синтез ферментов детерминирован, поэтому определение ферментативных свойств служит для идентификации организмов

2. Ферменты бактерии определяют их болезнетворность

3. Ферментативные свойства используются в микробиологической промышленности

Определение бактериальных ферментов

Протеазы расщепляют белки до аминокислот, мочевины, индола, сероводорода, аммиака. На средах с белком по выделению этих продуктов выявляют протеазы. Используют желатин, разжижение среды. На свернутой сыворотке по ее разжижению и на молоке по его просветлению. Казеин – будет разрушаться, белок свертываться. На МПБ по выделению газа индола и сероводорода, которые выявляют с помощью индикаторных бумажек

Определение ферментов, расщепляющих углеводы – сахаролитические. Эти ферменты расщепляют углеводы до альдегидов, кислот, углекислого газа, и  H2. Для их определения используют МПБ или МПА, добавляют индикатор кислотообрзазованияи + углевод + поплавок для газообразования. ПО такому принципу создают среды Гиса и Пестреля. Если свет среды меняется, выделяется газ, значит идет расщепление углеводов. Используют моносахара. На этом принципе создаются панели, планшеты, бумажные индикаторные системы, СИБ – системы индикаторных бумажек, энетротуба и приборы для учета ферментативной активности.(образуется угольная кислота => нужны  индикаторы с Ph)

Липолитические ферменты – липазы – выявляют на ЖСА – желточно солевой агар, который содержит желток, в котором много липидов и разрушение липидов сопровождается просветлением среды

Культивирование микроорганизмов.

-это получение большого числа бактерий на питательной среде. Цели  культивирования. Культивирования проводят для

1. Изучение микробиологических свойств

2. Для диагностики инфекций

3. Для получения биопрепарата – из бактерий или полученные с помощью бактерий.

Такими препаратами могут быть лечебными, диагностическими,  профилактические. Условия культивирования бактерии –

1. Наличие полноценной питательной среды.
2. Оптимальная температура
3. Атмосфера культивирования – либо кислород, либо его отсутствие.
4. Время культивирования – видимый рост через 18-48 часов, но некоторые – туберкулез например – 3-4- недели
5. Освещенность Некоторые будут расти только в присутствии света.

Способы культивирования аэробов

1. Стационарный – на поверхности агара
2. Метод глубинно культивирования с аэрацией среды. Аэрацию проводят для растворения кислорода в среде.
3. Непрерывное культивирование – используют проточные питательные среды.

Культуральные свойства микроорганизмов. Это особенности роста бактерий на питательных средах.

На жидких питательных средах бактерий вызывают помутнение  среды, могут образовывать осадок – придонный, пристеночный и могут образовывать пленку на поверхности среды. НА плотных питательных средах образуются колонии.

Колония – изолированное скопление микроорганизмов одного вида на плотной питательной среде. Имеет определенную величину, поверхность, край, форму, консистенцию, структуру, цвет.

Типы колоний

S-гладкие   - круглая форма, ровные края, гладкая поверхность.

R-колонии – шероховатые, неровные края, исчерченная поверхность

SR колонии 0 промежуточные – слегка неровные края и поверхность.

Особенности культивирования анаэробов. Для культивирования анаэробов создаются безкислородные условия. Это достигается

1. Регенерацией питательной среды – питательная среда кипятится и растворенный кислород выходит из среды.
2. использование специальных приборов – анаэростаты и эксикаторы. В них кислород поглощается либо химическими поглотителями, либо откачивается от прибора.
3. Добавление в среду редуцирующих веществ – веществ, которые легко и быстро окисляются – углеводы, цистеин, кусочки паренхиматозных органов, аскорбиновая кислота. НА этом принципе создана среда для анаэробов – Кит-Тароцци – среда для анаэробов. Она содержит МПБ, углевод и кусочки печени, которые содержат цистеин.
4. Специальные методы посева. Посев под масло, посев в трубке  Вейон- Веньяна, посев по Фортнеру. На чашку заселяют Аэробы и анаэробы – Аэробы поглощают кислород и получается анаэробная среда.

Выделение чистых культур.

Чистая культура – популяция микроорганизмов одного вида, выделенная на жидкой или плотной питательной среде в большом количестве.

Цели выделения.

1. Диагностика инфекций. Выделение чистых культур – основа бактериологического метода. Основан на выделение чистой культуры и ее идентификации. Идентификация – определение вида.
2. Получение биопрепаратов
3. Изучение биологических свойств бактерий
4. Санитарно-гигиеническое исследование

Этапы выделения чистой культуры аэробов.

1. Изучение смеси - мазок окраска по Грамму.
2. Разобщение смеси и получение колоний. Разобщение проводят 1) По Дригальскому – штрихами по поверхности агара. Петлей берут материал и засевают по агару. Посев Шпателя на несколько Чашек. 2)Метод серийных разведений. 3) Коха – метод серийных разведений в расплавленном агаре.
3. Проверка частоты колоний, мазок, окраска по грамму 
4. Пересев материала из колоний на скошенный агар для накопления чистой культуры. Выделенная чистая культура идентифицируется по свойствам – морфологическим, тинкториальным, культуральным, ферментативным, и другим.

Выделение чистой культуры анаэробов

1. Накопление анаэробов. Смесь засевают на среду Киттароци и прогревают при температуре 80 градусов 10 минут. Анаэробы, образующие споры сохраняются, а другие – вегетативные формы погибают. Затем питательная среда культивируется, споры прорастают, и накапливаются

2. Получение колоний по Цейслеру колонию анаэробов получают на поверхности агара в Анаэростате, по Вейнбергу, колонии получают в трубках Вейон-Виньяля.

3. Проверка частоты колоний – мазок, окраска по Грамму

4. Пересев Колоний на среду Киттароци, накопление анаэробом, чистой культуры.

5. Идентификация, определение вида анаэроба.

Другие способы выделения чистых культур.

1. Можно использовать оптимальные температуры
2. Выделение спор при прогревании смеси 10 минут при 80 градусах
3. Использование феномена роения – распространение за территорию посева.
4. Метод Шукевича – выделение чистой культуры микроорганизмов, обладающих ползучим ростом.
5. Фильтруемость бактерий – способность проходить через фильтры с определенной величиной спор. Обработка смеси ультрафиолетовыми лучами, ультразвуком, антисыворотками, получение чистой культуры, устойчивых к этим факторам микроорганизмов.
6. При электрофорезе смеси. У анода или катода будут скапливать организмы с определенным зарядом.
7. Использовать микроманипулятор. Под микроскопом взять клетку и получить чистую культуры – клон – потомство одной микробной клетки. Использование элективных питательных сред.
8. В питательные среды добавляют желчь, соли тиурита, натрийхлор, антибиотики, и выделяют чистую культуру устойчивых микроорганизмов.
9. Можно использовать дифференциально-диагностические среды.
10. Можно использовать биологический метод. Внутрибрюшинно заражают смесью бактерий белых мышей и за счет тропизма, бактерии накапливаются в определенном органе.

Пигменты бактерий.

Это красящие вещества, выделяемые бактериальной клеткой, их синтез генетически детерминирован. По химической структуре пигменты могут быть каратиноидами – красно-желтые, пирролы – зеленые, фенозиновые красители – сине-зеленые и меланиновые – черные ферменты.

Желтые – золотистый стафилакок, сине-зеленый - синегнойная палочка

Пигменты делятся на

1. Нерастворимые пигменты – окрашивают только колонии
2. Растворимые пигменты – могут быть растворимы в спиртах, воде

Пигменты образуются как правило у бактерий, которые находятся в воздушной микрофлоры, у антибиотико-резистентыных микроорганизмов, т.к. они вторичные метаболиты и пигменты часто образуются на свету.

Функция пигментов

1. Пигменты участвуют в обмене веществ
2. Повышают резистентность к антибиотикам
3. Повышают устойчивость к УФ лучам за счет того, что защищают области чувствительные к фотоокислению

L-формы бактерий.

 Открыты в 1935г. Это микроорганизмы, лишенные клеточной стенки, но сохранившие способность расти и размножаться. L формы образуются у большинства гетеротрофов и грибов. Факторы, индуцирующие L трансформацию –

1. Антибиотики

2. Аминокислоты – глицин, метионин, лейцин и некоторые другие.

3. Ферменты – лизоцим.

4. Факторы макрорганизма – макротела, комплимент

Эти факторы либо разрушают клеточную стенку, либо действовать на геном клетки и синтез компонентов клеточной стенки не происходит.

Свойства L форм.

1. L формы обеспечивают выживание бактерий при изменении условий среды.
2. Морфологически сходны у отдельных видов бактерий. Они полиморфны – шаровидные, грамотрицательные. Они образуют колонии типа А – мелкие колонии на поверхности среды и колонии типа Б – темный центр, и приподнятые края, колонии врастают в питательную среду.
3. Анаэробы или микроаэрофилы
4. L-формы имеют много способов размножения – бинарное деление, почкование, фрагментация, комбинированное.
5. Они обладают сниженной вирулентностью, у них нет адгезии и у них измененные антигенные свойства.
6. Они способны реверсировать – возвращаться в исходную бактериальную форму

И вызывать трудно поддающиеся лечению инфекции.

Это обусловлено тем, что L – формы, устойчивы к антибиотикам и они устойчивы к защитным факторам макроорганизма, к антителам, фагоцитозу, комплименту.

Некультивируемые формы бактерий НФБ

Это бактерии, которые имеют метаболическую активность, но не растут на питательных средах, переход в некультивируемую форму может наблюдаться у многих микроорганизмов, при воздействии неблагоприятных условий. Этот переход контролируется генетически. Переход осуществляется под действием факторов

1. Температура, особенно низкая
2. Концентрация солей
3. Аэрация среды
4. Количество питательных веществ

Значение некультивированных форм. В такой форме они сохраняются в о внешней среде между эпидемиями и при попадании в макроорганизм могут рекультивроваться – оживляться – это объясняет наличие природно очаговых заболеваний.

Выявление –

1. Прямой подсчет числа клеток

2. Выявление активности ДНК

3. Генетические методы исследования.