Современные технологии гематологического анализа

В настоящее время для подсчета и анализа клеток крови используют гематологические анализаторы разного уровня сложности.

Преимущество современных технологий подсчета и оценки форменных элементов крови:

высокая производительность (до 100-120 проб в час),

небольшой объем крови для анализа (12-150 мкл)

анализ большого массива (десятки тысяч) клеток

определение с высокой точностью и воспроизводимостью 20 и более параметров одновременно

графическое представление результатов исследований (гистограммы, скетограммы).

По сравнению с визуальной техникой автоматический подсчет более точный метод оценки концентрации клеток. Автоматизированный анализ крови открыл много новых диагностических возможностей, но одновременно он располагает и некоторыми ограничениями, особенно касающихся морфологических исследований клеток. Несмотря на все достоинства, даже самые современные анализаторы не в состоянии полностью заменить метод микроскопической оценки клеток.

Подготовка и проведение исследований на гематологических анализаторах

При выполнении анализа на гематологическом анализаторе предпочтительно использовать венозную кровь. Взятие венозной крови лучше осуществлять, применяя специальные одноразовые системы с ЭДТА - «МОНОВЕТ». Это гарантирует отсутствие в образце посторонних примесей, а наличие антикоагулянта в оптимальной концентрации предотвращает образование фибриновых сгустков и агрегацию тромбоцитов.

При взятии капиллярной крови оптимально использовать пробирки с ЭДТА - «МИКРОВЕТ». Нанесенный на внутреннюю поверхность пробирки мелкодисперсный порошок ЭДТА быстро растворяется в крови и надежно блокирует процессы свертывания крови и активации тромбоцитов.

Не следует использовать пробирки с выпаренным раствором ЭДТА. При испарении раствора на дне пробирки образуются крупные кристаллы ЭДТА, которые очень медленно
растворяются в крови. Это может приводить к образованию фибриновых нитей в верхней части пробы крови.

Не сдавливать палец пациента при взятии капиллярной крови и не накладывать жгут,
либо ослаблять его сразу же после прокола вены при взятии венозной крови.

Не забирать кровь со стекла.

Цельная кровь имеет высокую вязкость и поэтому трудно перемешивается. Перед началом измерения цельную кровь следует перемешивать плавным переворачиванием и вращением пробирки в течение не менее 2 минут. Для этих целей лучше всего использовать специальный гематологический шейкер.

При ручном перемешивании цельной крови недопустимы резкие встряхивающие движения, так как они приводят к механическому лизису эритроцитов.

Для дезинфекции подушечки пальца перед взятием крови и высушивания носика пробирки следует использовать специальные безворсовые салфетки. Помните, что применение ватных тампонов и других волокнистых материалов подобного рода приводит к засорению волокнами датчика подсчета клеток и гемоглобиновой камеры (для этого достаточно даже одного волокна!). В результате точность и воспроизводимость измерения концентрации гемоглобина резко падает. Извлечение посторонних частиц из камеры требует повышенного расхода промывающего раствора, а в ряде случаев, даже частичной разборки прибора.

При работе в режиме предилюции следует учитывать, что образование пузырьков при разведении крови с использованием дилютора может приводить к лизису клеток крови и, как следствие, являться причиной завышения результатов подсчета тромбоцитов. Поэтому необходимо следить, чтобы жидкость стекала по стенке стаканчика без образования пузырьков.

Во избежание случаев несовместимости реагентов следует использовать изотонический раствор и гемолитик от одного изготовителя. При смене реагентов одного производителя на реагенты другого производителя обязательно консультируйтесь с инженерно-сервисной службой, так как может понадобиться перекалибровка прибора.

При эксплуатации гематологических анализаторов важную роль играет качество электрической сети и заземления. Внезапное отключение электропитания часто приводит к сбоям в работе приборов и необходимости вмешательства инженеров сервисной службы. В том случае, если электрическое питание пропадает в момент забора пробы или анализа, и появляется спустя несколько часов (5 - 20), последствия могут оказаться просто плачевными - может выйти из строя гидравлика, засориться сгустками крови капиллярные трубки, апертура и т.д. Поэтому прибор должен работать с источником бесперебойного питания.

Периодически необходима калибровка по стандартным материалам, так как электронные и механические компоненты прибора, датчиков, насосов и т.д. со временем подвергаются старению и меняют свои технические параметры. Для осуществления калибровки, необходимо пользоваться только качественными контрольными материалами!

Проточные гематологические анализаторы

На основании количества определяемых параметров и степени сложности их можно условно разделить на 3 основных класса:

I класс - полуавтоматические и автоматические счетчики клеток крови, позволяющие определять до 8-10 параметров, включая WBC, RBC, Hb, Ht, MCV, MCH, MCHC, PLT, MPV без дифференцировки лейкоцитов.

II класс - автоматические гематологические анализаторы, определяющие до 20 параметров, включая расчетные показатели красной крови и тромбоцитов, гистограммы распределения лейкоцитов, эритроцитов и тромбоцитов по объему, а так же частичную дифференцировку лейкоцитов на три популяции - лимфоциты, средние клетки и гранулоциты.

III класс - высокотехнологичные гематологические анализаторы, позволяющие проводить развернутый анализ крови, включая полную дифференцировку лейкоцитов по 5-ти параметрам (нейтрофилы, эозинофилы, базофилы, моноциты и лимфоциты), гистограммы распределения лейкоцитов, эритроцитов и тромбоцитов по объему, скетограммы.

В основе работы анализаторов 1-го и 2-го классов лежит кондуктометрический метод.

Анализаторы 3-го класса используют комбинации различных методов для подсчета клеток и дифференцировки лейкоцитов.

Кондуктометрические счетчики

Технология автоматического подсчета клеток была разработана в 1947 г. Wallace H. и Joseph R. Coulter. Апертуро-импедансный метод (метод Культера или кондуктометрический метод) основан на подсчете числа и определении характера импульсов, возникающих при прохождении клеток через отверстие малого диаметра (апертуру), по обе стороны которого расположены два изолированных друг от друга электрода. Если через узкий канал, заполненный электропроводящим раствором, проходит клетка крови, то в этот момент сопротивление электрическому току в канале слегка возрастает и хотя это изменение невелико, современные электронные приборы легко его улавливают. Каждое событие - прохождение клетки через канал, сопровождается появлением электрического импульса. Чтобы определить концентрацию клеток достаточно пропустить определенный объем пробы через канал и сосчитать число электрических импульсов, которые при этом генерируются.

Если в один момент в канале находятся две клетки, то все равно получается только один импульс, и это приведет к ошибке подсчета клеток. Во избежание этого, необходимо развести пробу крови до такой концентрации, при которой в канале датчика всегда будет не больше одной клетки.

Высокотехнологичные гематологические анализаторы

Эти гематологические анализаторы способны осуществлять дифференцированный счет лейкоцитов по 5-ти основным категориям: нейтрофилы, эозинофилы, базофилы, моноциты и лимфоциты. Кроме того данные приборы обладают системой "сигналов тревоги", предупреждающей оператора о наличии в исследуемых образцах крови патологических клеток. Принципы, положенные в основу пятичленной дифференцировки лейкоцитов, различаются у разных производителей.

Трехмерный анализ дифференцировки лейкоцитов – VCS

VCS-технология является запатентованным методом дифференцировки лейкоцитов в анализаторах фирмы Bekman-Coulter (США-Франция).

Технология VCS (Volume - Conductivity -Scatter) включает в себя одновременный компьютерный анализ клеток по трем направлениям:

объем (Volume)

электропроводность (Conductivity)

дисперсия лазерного света (Scatter).

Основные характеристики, оцениваемые данным методом:

Объем клеток определяется сопротивлением (импеданс) для тока низкой частоты

Величина и плотность внутренних структур клетки определяет электропроводность клеток для тока высокой частоты

Комбинированную информацию о размере клеток, ее гранулярности, поверхностной топографии несет отражение, поглощение и рассеивание лазерного луча

Полученные по трем каналам данные с помощью электроники комбинируются и анализируются, в результате чего происходит распределение клеток по дифференцировочным кластерам и, таким образом, лейкоциты разделяются на пять основных популяций: лимфоциты, моноциты, нейтрофилы, эозинофилы и базофилы.

Изменение дисперсии лазерного света клетками – MAPSS технология.

В системах Cell-Dyn фирмы Abbot (США), Sysmex (SF 3000) для дифференцировки лейкрцитов применена технология MAPSS – мультипараметрическая система лазерного светорассеивания – регистрация интенсивности рассеивания клетками поляризованного лазерного луча под разными углами. Рассеивание клеткой поляризованного лазерного луча под разными углами дает сведения о таких ее свойствах как:

размер клеток - для чего оценивается прохождение поляризованного лазерного луча под малым углом рассеивания (0°),

структура и степень сложности клеток - оценивается по анализу рассеивания поляризованных лазерных лучей, направленных под углом до 7°,

ядерно-цитоплазматическое соотношение - оценивается по анализу рассеивания поляризованных лазерных лучей, направленных под углом до 10°,

оценка формы клеточного ядра - осуществляется благодаря анализу светорассеивания поляризованных лазерных лучей под углом 90°,

для оценки клеточной зернистости и дифференцировки эозинофилов используется оценка светорассеивания деполяризованного луча под углом в 90°.

Измерение активности пероксидазы в лейкоцитах – PEROXchannel

В приборах фирмы Bayer (Technicon серии Н, ADVIA) разработан принцип жидкостной цитохимии - реакции на пероксидазу.

Использование данной реакции связано с различной активностью ее в лейкоцитах. Так, эозинофилы и нейтрофилы имеют интенсивную пероксидазную активность, моноциты - слабую, в лимфоцитах она не выявляется.

Приборы одновременно измеряют абсорбцию и дисперсию видимого света.

Основные показатели, получаемые с помощью гематологических анализаторов и факторы, влияющие на их значение

WBC (white blood cells) - количество лейкоцитов крови (х109/л). Коэффициент вариации (CV) при автоматическом определении этого показателя составляет 1-3%, в то время как при ручном подсчете 6,5-15% в зависимости от числа лейкоцитов. Измерение лейкоцитов проводится после полного лизиса эритроцитов в пробе.

RBC (red blood cells) - количество эритроцитов крови (х1012/л). Подсчет эритроцитов осуществляется в цельной крови (содержащей помимо эритроцитов еще и тромбоциты и лейкоциты). Поэтому измерению эритроцитов должно предшествовать соответствующее разведение крови для уменьшения интерференции со стороны лейкоцитов. Кроме того, при увеличении числа лейкоцитов ошибка оценки эритроцитов прогрессивно нарастает, при лейкоцитозе более 50х109/л может искажаться показатель объема эритроцитов (MCV) . Коэффициент вариации для данного параметра составляет 1-2% , а для некоторых приборов - менее 1%.

HGB (hemoglobin) - концентрация гемоглобина (г/дл или г/л) в большинстве гематологических анализаторах определяется спектрофотометрически гемиглобинцианидным методом. Коэффициент вариации при этом не превышает 2% .

НСТ (hematocrit) - гематокрит. В автоматических анализаторах крови НСТ представлен суммой прямо измеренных объемов эритроцитов в единице объема крови и проблемы "остаточной" плазмы не существует. Коэффициент вариации для автоматического метода - менее 1% , в сравнении с 1-2% при определении показателя методом центрифугирования.

MCV (mean corpuscular volume) - средний объем эритроцита, выражается в кубических микрометрах (мкм3) или в фемтолитрах(1фл = 1мкм3). MCV определяется большинством гематологических анализаторов благодаря прямой зависимости амплитуды электрического импульса от объема клетки. Вычисляется MCV делением суммы клеточных объемов на число эритроцитов.

В то же время MCV - это средний показатель объема всей популяции клеток. Поэтому необходимо иметь в виду, что MCV может иметь нормальное значение при наличии у пациента одновременно выраженного макро- и микроцитоза. В этом случае особую диагностическую важность приобретает анализ гистограмм.

МСН (mean corpuscular hemoglobin) - среднее содержание гемоглобина в эритроцитах (пг). Характеризует среднее содержание гемоглобина в отдельном эритроците в абсолютных единицах. Изменения МСН лежат в основе разделения анемий на нормо-, гипо- и гиперхромные. МСН - более объективный параметр, чем цветовой показатель, который не отражает синтез гемоглобина и его содержание в эритроците.

МСНС (mean corpuscular hemoglobin concentration) - средняя концентрация гемоглобина в эритроците (г/дл). Показатель МСНС отражает истинное насыщение эритроцита гемоглобином, поскольку величина среднего содержания гемоглобина в эритроците (МСН) зависит от объема клетки, а МСНС нет.

Снижение значения МСНС наблюдается при заболеваниях, сопровождающихся нарушением синтеза гемоглобина. Увеличение же параметра МСНС выше нормальных значений свидетельствует об ошибках, допущенных при измерении данной пробы (погрешности определения гемоглобина или MCV), т.к. превышение концентрации гемоглобина выше определенного физиологического уровня привело бы к разрушению (гемолизу) эритроцитов, чего не наблюдалось в данной пробе. Таким образом, данный параметр может быть использован как индикатор ошибок, допущенных на аналитическом или преаналитическом этапах работы.

RDW (red cell distribution width) - показатель гетерогенности эритроцитов по объему, характеризует степень анизоцитоза. RDW определяет величину колебания эритроцитов по объему, по этому параметру анизоцитоз улавливается прибором значительно быстрее, чем при визуальном просмотре мазка крови. Оценка степени анизоцитоза под микроскопом сопровождается целым рядом ошибок. При высыхании в мазках диаметр эритроцитов уменьшается на 10-20%. В толстых препаратах он меньше, чем в тонких. В то же время показатель RDW характеризует колебания объема клеток внутри популяции и не связан с абсолютной величиной объема эритроцитов. Поэтому при наличии в крови популяции эритроцитов с измененным, но достаточно однородным размером (например, микроциты), значения RDW могут быть в пределах нормы (11,5-14,5%).

PLT (platelet) - количество тромбоцитов (х109/л). В отличие от ручного подсчета тромбоцитов, где проводится предварительный лизис эритроцитов, автоматические счетчики крови анализируют тромбоциты и эритроциты в одной камере без предварительной обработки. Это создает проблему дифференцирования больших форм тромбоцитов (макротромбоцитов) и сравнимых с ними по объему эритроцитов (микроцитов), их фрагментов (шизоцитов), а также отшнуровавшихся фрагментов цитоплазмы лейкоцитов (клеточный дебрис).

MPV (mean platelet volume) - средний объем тромбоцитов выражается в фемтолитрах (фл) или мкм3. В норме этот показатель варьирует от 7,4 до 10,4 фл и имеет тенденцию к увеличению с возрастом: с 8,6 - 8,9 фл у детей 1-5 лет до 9,5-10,6 фл у людей старше 70 лет. "Молодые" кровяные пластинки имеют больший объем, поэтому при ускорении тромбоцитопоэза средний объем тромбоцитов возрастает. Увеличение среднего объема тромбоцитов наблюдается при идиопатической тромбоцитопенической пурпуре, гипертиреозе, атеросклерозе, сахарном диабете, у курильщиков и лиц, страдающих алкоголизмом. Преходящая макротромбоцитемия описана у рабочих, контактирующих с асфальтовыми испарениями, лиц, работающих с ракетным топливом. Крупные тромбоциты с аномальной морфологией появляются при миелопролиферативных заболеваниях. Уменьшение этого показателя отмечается после спленэктомии и при синдроме Вискотта-Олдрича. В течение первых двух часов после взятия крови с ЭДТА происходит набухание тромбоцитов с изменением их объема и соответственно увеличение MPV.

PDW (platelet distribution width) - ширина распределения тромбоцитов по объему измеряется в процентах (коэффициент вариации тромбоцитометрической кривой) и количественно отражает гетерогенность популяции этих клеток по размерам (степень анизоцитоза тромбоцитов). В норме этот показатель составляет 10-20%. Изменяется при миелопролиферативных заболеваниях.

РСТ (platelet crit) - тромбокрит) является параметром, который отражает долю объема цельной крови, занимаемую тромбоцитами, выражается в процентах. В норме тромбокрит составляет 0,15-0,40%.

Диагностическое значение этих тромбоцитарных индексов в настоящее время не определено.